白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验探究

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1、白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验探究［摘要］神经干细胞(NSCs)具有替代及修复受损神经组织的作用，研究发现能够通过调控NSCs内环境诱导其增殖分化，重塑神经功能，从而修复脑卒中神经病变等神经系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组(BMECG)激活NSCs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模型，模拟脑卒中神经病变，分别利用流式细胞术、行为学检测、Nestin免疫组化等方法研究BMECG的脑保护作用机制。结果表明，BMECG能够显著提高体外培养NSCs增殖能力，有助于小鼠的行为学功能恢复，明显改善模型小鼠大脑皮层NSCs增殖能力。因此

2、BMECG直接针对NSCs增殖存活能力发挥作用，可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一，该药物具有重要的研究意义和广阔的应用前景。［关键词］白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中;竣基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法［收稿日期］2013-04-18［基金项目］国家自然科学基金面上项目(81173657)［通信作者］*陈小玉，E-mail：xiaoyu0767@163、com［作者简介］刘庆山，Tel/Fax：(010)68933254,E-mail：nlqsh@163>com“有效成分组"是指复方中与治疗目的密切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的

3、重要指导理论之一[1]。白脉散有效成分组（Baimaieffectivecompoundsgroup,BMECG）是课题组在“复方有效成分组"理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”，由人参皂昔血1、胡黄连昔II、牛磺酸等组成，成分清楚，质量可控[2-3]o白脉散源自《四部医典》，临床可用于治疗白脉病等病症[4],为发挥民族药大复方多组分、多靶点的特点，对其有效成分进行深入研究，研究BMECG对脑卒中神经病变的作用和机制，本研究釆用体外实验及整体实验，对BMECG影响NSCs的作用进行了研究。1材料1、1动物一日龄Wistar大鼠，SPF

4、级，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK（京）2006-0008；健康雄性昆明小鼠，SPF级，体重（20±2）g,购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0017o1、2药品人参皂昔Rgl（纯度98%,昆明双星科技开发有限公司）,胡黄连昔II（纯度90%,南京景竹生物科技公司），白脉散有效成分组为本实验室自制，由人参皂昔Rgl、没食子酸、胡黄连昔II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%,30%,33%,4%组成。1、3试剂胎牛血清（澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司分装）；DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27

5、（Gibco公司）；重组牛碱性成纤维生长因子bFGF（珠海亿胜生物制药有限公司）;MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗（Sigma公司）；CFDA-SE试剂盒（碧云天生物技术研究所）；FITC标记山羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒、Mayor苏木素（武汉博士德生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（碧云天生物技术研究所）；其余试剂均为市售分析纯。1、4仪器ZB-200平衡转棒仪（成都泰盟软件有限公司）；超净工作台（北京医疗设备厂）；CB150二氧化碳培养箱（德国Binder）；HERAcell150

6、三气培养箱（美国Thermo公司）；流式细胞仪（FACSCalibur,BD公司，美国）；1X81自动型倒置荧光显微镜（日本0lympus公司）；5804R型低速冷冻离心机（德国艾本德公司）。2方法2、1体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备2、1、1原代培养大鼠NSCs取一日龄新生大鼠，以75%乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层置于4°CPBS中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2mL培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1000r•min-1离心5min,弃上清，加入DMEM/F12完全培养基（含bFGF50u

7、g-L-l,2%B27）,吹打成细胞悬液。0、4%台盼蓝计数，调整细胞密度，按5X105个/mL接种于25cm2细胞培养瓶中。置于37°C,5%CO2培养箱中悬浮培养，待NSCs形成克隆球后适时传代［5］。首先利用NSCs特异性表面标记物巢蛋白（Nestin）按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后应用Image-Pro-Plus6、0软件进行处理，观察克隆球数目变化及直径计算其增殖能力。培养3〜4d后，培养基中可见桑套样的细胞克隆聚集物，直径多为70urn左右，折光性强，细胞边界清楚。培养至第5天，克隆

8、球的数量、直径均有明显增加，由数百个细胞组成，形态较规则，平均直径约为100Pmo常规培养至第7天，可见大量NSCs典型的