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时间:2019-03-01
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1、白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验探究[摘要]神经干细胞(NSCs)具有替代及修复受损神经组织的作用,研究发现能够通过调控NSCs内环境诱导其增殖分化,重塑神经功能,从而修复脑卒中神经病变等神经系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组(BMECG)激活NSCs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模型,模拟脑卒中神经病变,分别利用流式细胞术、行为学检测、Nestin免疫组化等方法研究BMECG的脑保护作用机制。结果表明,BMECG能够显著提高体外培养NSCs增殖能力,有助于小鼠的行为学功能恢复,明显改善模型小鼠大脑皮层NSCs增殖能力。因此
2、BMECG直接针对NSCs增殖存活能力发挥作用,可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一,该药物具有重要的研究意义和广阔的应用前景。[关键词]白脉散;有效成分组;神经干细胞;脑卒中;竣基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法[收稿日期]2013-04-18[基金项目]国家自然科学基金面上项目(81173657)[通信作者]*陈小玉,E-mail:xiaoyu0767@163、com[作者简介]刘庆山,Tel/Fax:(010)68933254,E-mail:nlqsh@163>com“有效成分组"是指复方中与治疗目的密切相关的活性成分的总和,是传统复方现代化的
3、重要指导理论之一[1]。白脉散有效成分组(Baimaieffectivecompoundsgroup,BMECG)是课题组在“复方有效成分组"理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”,由人参皂昔血1、胡黄连昔II、牛磺酸等组成,成分清楚,质量可控[2-3]o白脉散源自《四部医典》,临床可用于治疗白脉病等病症[4],为发挥民族药大复方多组分、多靶点的特点,对其有效成分进行深入研究,研究BMECG对脑卒中神经病变的作用和机制,本研究釆用体外实验及整体实验,对BMECG影响NSCs的作用进行了研究。1材料1、1动物一日龄Wistar大鼠,SPF
4、级,购自北京维通利华有限公司,许可证号SCXK(京)2006-0008;健康雄性昆明小鼠,SPF级,体重(20±2)g,购自北京维通利华有限公司,许可证号SCXK(京)2009-0017o1、2药品人参皂昔Rgl(纯度98%,昆明双星科技开发有限公司),胡黄连昔II(纯度90%,南京景竹生物科技公司),白脉散有效成分组为本实验室自制,由人参皂昔Rgl、没食子酸、胡黄连昔II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%,30%,33%,4%组成。1、3试剂胎牛血清(澳大利亚进口,浙江天航生物科技有限公司分装);DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27
5、(Gibco公司);重组牛碱性成纤维生长因子bFGF(珠海亿胜生物制药有限公司);MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗(Sigma公司);CFDA-SE试剂盒(碧云天生物技术研究所);FITC标记山羊抗兔二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司);DAB显色试剂盒、Mayor苏木素(武汉博士德生物工程有限公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物技术研究所);其余试剂均为市售分析纯。1、4仪器ZB-200平衡转棒仪(成都泰盟软件有限公司);超净工作台(北京医疗设备厂);CB150二氧化碳培养箱(德国Binder);HERAcell150
6、三气培养箱(美国Thermo公司);流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司,美国);1X81自动型倒置荧光显微镜(日本0lympus公司);5804R型低速冷冻离心机(德国艾本德公司)。2方法2、1体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备2、1、1原代培养大鼠NSCs取一日龄新生大鼠,以75%乙醇浸泡灭菌,置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层置于4°CPBS中,剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2mL培养基剪成泥状,用吹打法分散细胞,200目钢筛过滤。1000r•min-1离心5min,弃上清,加入DMEM/F12完全培养基(含bFGF50u
7、g-L-l,2%B27),吹打成细胞悬液。0、4%台盼蓝计数,调整细胞密度,按5X105个/mL接种于25cm2细胞培养瓶中。置于37°C,5%CO2培养箱中悬浮培养,待NSCs形成克隆球后适时传代[5]。首先利用NSCs特异性表面标记物巢蛋白(Nestin)按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。给药后每天选取6个不同视野,在倒置显微镜下拍照,最后应用Image-Pro-Plus6、0软件进行处理,观察克隆球数目变化及直径计算其增殖能力。培养3〜4d后,培养基中可见桑套样的细胞克隆聚集物,直径多为70urn左右,折光性强,细胞边界清楚。培养至第5天,克隆
8、球的数量、直径均有明显增加,由数百个细胞组成,形态较规则,平均直径约为100Pmo常规培养至第7天,可见大量NSCs典型的
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