雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系的建立及其衍生后代生物学特性的研究

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1、湖南师范大学博士学位论文雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系的建立及其衍生后代生物学特性的研究姓名：王静申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：刘筠;刘少军20100401中文摘要通过红鲫(Carassiusauratusredvat．，早)与鲤鱼(CyprinuscarpioL．，8)远缘杂培育出两性可育的异源四倍体鲫鲤群体(AT)。AT能稳定产生二倍体精子和卵子，对其产生的二倍体卵子进行雌核发育研究，建立了一个能稳定产生二倍体卵子的雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系(Gl～G5)。利用雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系产生的二倍体卵子与四倍体鲫鲤产生的二倍体精子杂交获得了改良四倍体鲫

2、鲤GxAT。重要的是，在改良四倍体鲫鲤群体(Gl×AT)中选育／k12％的高背型个体。高背型Gl×AT自交，后代分化形成3种二倍体鱼：高背型红鲫、高背型双尾金鱼和高背型青灰色鲤鱼。本文主要研究内容包括：①雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系的建立及其遗传机制研究；②对人工双尾金鱼的细胞和分子生物学特性进行深入分析，来探讨金鱼的起源与进化问题；③高背型鲫鱼和高背型青灰色鲤鱼的生物学特征及其应用。具体研究内容如下：1．在已获得雌核发育二倍体鲫鲤第三代G3的基础上，制备出G4和G5。建立了一个能稳定产生二倍体卵子的雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系(Gl~G5)。为进一步研究二倍体鱼产生二

3、倍体卵子的机制，我们对G5早期性腺进行体外组织培育。在早期性腺生长增殖中，发现大量生殖细胞发生融合的现象。而在对照组早期草鱼和鲤鱼性腺的体外培育中，至今未发现生殖细胞融合的现象。这对揭示二倍体杂交鱼产生二倍体配子的机制具有重要的价值。2．对高背型人工双尾金鱼(AG)的外形及细胞生物学特征进行研究。结果表明，AG与普通金鱼(NG)的可量性状和可数性状基本一致；AG与原始母本RCC的一些外形特征更为相似，而与原始父本CC的外形特征差异较大。从外形特征上可以初步判断金鱼与鲫鱼的亲缘关系比较近。流式细胞仪测定结果表明AG是一种二倍体鱼。染色体检测表明AG染色体数为2n=10

4、0，染色体核型公式为22m+34sm+22st+22t。通过对AG性腺的显微结构和超微结构观察，发现它们具有正常的精巢和卵巢结构，两性个体一年性成熟，分别能产生成熟的单倍体精子和卵子。3．在AG分子遗传特性研究中，首先对NG、AG、RCC和CC的Sox基因进行检测。AG与RCC的Sox基因扩增条带一致，同为--,200、“oo和～1900bp的扩增带，而在NG中只存在---200和-一600bp的条带，CC中只存在~200和～900bp的扩增带。另外，对这四种鱼的5SrDNA进行PCR扩增，结果表明NG与AG具有相同的扩增带，它们以具有独特的168bp条带而异于RC

5、C和CC。同时在对5SrDNA进行染色体定位研究中，发现NG、AG和RCC的原位杂交结果一致，它们都具有两个较强的杂交信号，而在CC染色体中没有检测到相关信号。对AG线粒体DNA全长进行测序。AG粒体基因组全序列长为16579bp，其结构和基因排列与其他鲤科鱼一致。对线粒体全序列进行比对，AG与原始亲本RCC和CC的相似比分别为99．5％和89．4％，符合线粒体母性遗传规律；AG与NG的相似比高达99．4％，表明两者可能具有相同的起源。从鲤鱼和鳙鱼的微卫星引物中筛选出7对引物对NG、AG、RCC和CC群体进行微卫星检测。结果表明，在AG群体中各等位基因数为1～8个，

6、大小在140一-'300bp，群体呈现了高度的遗传多态性，遗传异质性较大，表明基因组来源复杂，基因高度杂合。4．对高背型鲫鱼相关生物学特征进行研究，结果表明它们是一种二倍体鱼，两性可育，一年性成熟；它们在外形上具有体背高、尾柄短、头部小的优良特性。用雌性高背型鲫鱼与雄性改良四倍体鲫鲤交配，获得了改良三倍体鲫鱼。这种改良三倍体鲫鱼不仅在外形上继U承了母本高背特征，而且具有生长速度快、不育、营养成分含量高等特征。5．对高背型青灰色鲤鱼(ICC)及其自交后代的外形、倍性、性腺发育以及Sox基因进行研究。结果表明ICC与普通鲤鱼(CC)相比，ICC在外形上具有显著的高背特征

7、。ICC是一种二倍体鱼，两性可育，一年性成熟。值得注意的是Sox基因检测结果表明ICC是一种杂交个体，具有与AT一致的扩增带(--,200、---600、～900和～1900bp)，而CC为～200和～900bp的扩增带。上述研究结果说明经雌核发育效应改良的远缘杂交后代能分化形成了不同类型的新品种鱼，它们在外形和遗传特性方面都发生了重大变化。对三种不同种类高背型鱼的形成及生物学特征进行研究，在生物进化和遗传育种中具有重要意义。而人工双尾金鱼的形成为研究金鱼的起源与进化提供了直接的证据。关键词：雌核发育，雌核发育二倍体鲫鲤，改良二倍体鱼，金鱼，起源与进化mABST