绵羊notch1胞内结构域的克隆及其对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：豫红铨时间：劲I*年06月f>日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和

2、借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：职乡上诌导师签名：司明耳时间：劲睥年口占月f1日时间：山14年胡月』≥日万方数据本文是自治区自然科学基金的部分研究成果(项目编号：2013211830)万方数据绵羊Notchl胞内结构域的克隆及其对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用摘要Notchl基因突变能够造成果蝇的残翅，因此而得名。Notch信号通路是调节胚胎期和出生后卫星细胞激活与增殖的一个重要的信号通路，能够影响骨骼肌卫星细胞的特异性及其细胞命运决定，通过调控细胞的增殖、

3、分化和凋亡从而影响肌肉生长。目前，尚未见到绵羊Notch基因的有关报道，尚不清楚Noah基因对绵羊肌卫星细胞的功能和作用，因此，克隆绵羊Notch基因，明确其对绵羊肌卫星细胞的作用，对进一步研究绵羊骨骼肌的发育机制具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法克隆了绵羊Notchl胞内段NICD基因，将其与慢病毒表达载体pLEX-mcs连接，构建了pLEX-NICD真核表达载体。利用Preplate法分离了绵羊肌卫星细胞，并采用免疫荧光技术和流式细胞术分析细胞纯度，通过慢病毒感染建立了ptF_x-NICD稳定转染的绵羊肌卫星细胞系，采用细胞生长曲线测定、流式细胞术以及免疫荧光技术分析了在过表达情况

4、下NICD对绵羊肌卫星细胞增殖和分化的作用。进一步通过qRT-PCR检测了Noah信号通路相关基因的表达变化，从细胞水平探讨了NICD对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用机制。本研究获得的主要结果如下：l、克隆了2388bp绵羊Notch胞内段序列，并提交至Genbank(登录号：KF318190．1)。在绵羊肌卫星细胞中过表达NICD，Westernblotting检测显示，NICD在绵羊肌卫星细胞中获得表达。2、利用Preplate差速贴壁法从胎羊肌肉组织中分离培养了肌卫星细胞，利用P甜7、Desmin和MyoD免疫荧光鉴定分离培养的卫星细胞纯度，同时通过流式细胞术确定了纯度达94％。3、细

5、胞生长曲线结果显示，稳定表达NICD基因的肌卫星细胞相较对照细胞生长速度显著减慢(从第二天开始培养至第六天差异极显著(P

6、增殖；分化状态下，Notch下调MyoD基因的表达，提示^b^柏通过负调控MyoD基因的表达抑制绵羊肌卫星细胞分化。研究结果表明NICD具有抑制绵羊肌卫星细胞增殖和分化的作用。综上所述，本研究克隆了2388bp的绵羊Notch胞内段基因，成功构建了其慢病毒表达载体pLEX-NICD，经慢病毒感染，获得了稳定表达NICD的绵羊肌卫星细胞系，经细胞生长曲线和流式细胞周期检测，证明NICD基因对绵羊肌卫星细胞增殖及分化具有抑制作用。关键词：绵羊肌卫星细胞；NICD基因；细胞增殖：细胞分化II万方数据CloningoftheintracellulardomainofNotchlanditsrolei

7、nproliferationanddifferentionofovinesatellitecellsAbstractTheNotchlgenewasnamedbythatitsmutationinDrosophilacausedirregularnotchesatthewingmargin．Notchsignalingpathwayplaysessentialroleinregulationofprolife