mapk通路在fgf9对三种成骨向分化细胞中的作用和机制研究

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1、博士学位论文MAPK通路在FGF9对三种成骨向分化细胞中的作用和机制研究作者姓名：卢境婷学号：0117239222学科专业：口腔临床医学指导教师：沈国芳教授指导小组成员：房兵教授；王旭东教授；张诗雷副教授；林艳萍副教授研究方向：颅颌面畸形的临床与基础研究申请学位：博士培养单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院关键词：FGF9；骨髓基质干细胞；颅骨来源的间充质细胞；牙髓干细胞；体外培养；成骨分化；MAPK通路答辩日期：2014年4月基金资助项目：国家高技术研究发展计划项目(SQ2009AA04ZXl485930)国家自然科学基金(8127

2、1】22)上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将

3、本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海交通大学医学院2011级博士学位论文MAPK通路在FGF9对三种成骨向分化细胞中的作用和机制研究人类骨骼发育是一个复杂而精密的过程。l994年研究表明，FGFs家族突变是造成侏儒症的重要原因，人类首次发现FGFs家族与骨骼发育具有十分密切的关系。随后，越来越多的研究表明，FGFs家族对骨骼发育

4、具有十分重要的影响——FGFs的相关突变常造成各种侏儒症和颅缝早闭综合征。其中，颅缝早闭综合征是发生在颌面部的一种特殊的骨骼发育畸形，它不仅造成患者容貌异常，且、手术治疗效果十分有限。因此对颅缝早闭综合征发生机理的研究，是颅颌面发育的研究重点。有研究表明，颅缝早闭综合征主要是由FGFR2突变所造成，而FGFR2突变后，FGF9结合速率显著提高，这提示我们FGF9可能和多种颅缝早闭综合征相关，但FGF9对成骨分化的具体作用，目前仍存疑义：一些研究认为FGF9促进成骨，另一些研究结果则完全相反。因此，本实验旨在同一的体外条件下，对不同来源的成

5、骨细胞进行成骨诱导，重点研究FGF9对成骨分化过程的影响，以及MAPK通路在这一过程中的作用机制。目的1．研究FGF9对骨髓基质干细胞、颅骨来源间充质细胞和牙髓干细胞体外成骨分化的影响。2．探讨MAPK通路在FGF9对以上三种细胞体外成骨分化影响中的作用机制。方法1．对骨髓基质干细胞行体外成骨诱导，加入梯度浓度的外源性FGF9，采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色，检测ALP的表达和钙结节的形成情况，初步研究l上海交通大学医学院2011级博士学位论文FGF9对骨髓基质干细胞体外成骨分化的影响，同时确定最佳刺激浓度。再通过实时荧光定量聚合酶链反应

6、和蛋白免疫印迹技术，检测相关成骨基因如RUNX2、COLI、OPN、OCN的基因及蛋白表达水平，明确FGF9对骨髓基质干细胞体外成骨分化的影响。2．在同一实验条件下，对颅骨来源间充质细胞和牙髓干细胞行体外成骨诱导，根据前期实验确定的最佳刺激浓度，在加入外源性FGF9的情况下，重复检测相关成骨指标，研究FGF9对颅骨来源的间充质细胞和牙髓干细胞的体外成骨分化的影响。3．通过蛋白质免疫印迹技术，检测MAPK通路相关蛋白是否发生磷酸化，明确FGF9是否可以激活以上三种细胞的MAPK通路。4．加入MAPK通路的抑制剂U0126、SB203580、

7、SP600125，分别抑制MAPK通路内的ERKl／2、P38、JNK通路，再加入外源性FGF9，并重复检测以上相关成骨指标的表达情况，确定MAPK通路是否介导FGF9对以上三种细胞的体外成骨分化的作用。结果1．外源性FGF9的加入，抑制骨髓基质干细胞在体外成骨分化过程中ALP的表达和钙结节的形成，且这种抑制作用呈浓度依赖趋势一一浓度越高，成骨分化抑制作用越强；同时FGF9抑制了骨髓基质干细胞相关成骨基因，如RUNX2、COLI、OPN、OCN的表达。2．FGF9抑制颅骨来源的间充质细胞和牙髓干细胞在体外成骨诱导过程中相关成骨标记物的表达

8、和钙结节的形成。3．FGF9可分别激活骨髓基质干细胞、颅骨来源的间充质细胞和牙髓干细胞的MAPK通路，使ERKl／2、P38、JNK发生磷酸化，分别生成p-ERKl／2、p-P38、p-J-N