[指导]蛋白质羰基含量检测

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1、苏州大学实验报告姓名孙海洪学号20094221059专业生物化学与分子生物学实验名称蛋白质拨基含量检测实验日期2009・12・2一、实验目的通过实验掌握蛋口琰基含量测定的原理和操作方法以及掌握蛋口按基含量检测试剂盒的使用方法。二、实验原理蛋白质是生命活动的物质基础，约占人体固体成分的45%,在维持细胞、组织的生长、更新、修补，以及催化、运输、代谢调节等生命活动中起重要作川。蛋白质以很高的浓度存在于细胞、组织当中，就使它成为自市基攻击的一个主要目标。儿乎组成蛋口质的所有氨基酸对・OH及0・一2攻击都很験感。蛋白质侧链氨基酸被

2、氧化修饰后拨基的含量人人增加并成为蛋口质丧失正常功能甚至被降解的重要原因o1987年Olivei•等人经研究提出可以用蛋口质拨基含量作为判定蛋口质氧化损伤的一项指标。蛋白质拨基化是指氨基酸残基侧链屮的氨基或亚氨基受到氧白由基攻击最后转变成醛基，并释放NH3十的过程。其在体内的形成主要是通过金属离了催化氧化系统完成。在这个过程中，二价铁离了与蛋白质上的氨基酸残基形成铁(II)一蛋白质配位复合物。出02作用于此配位复合物的铁(II)上，产生・OH、OFT和铁(III)一蛋口质配位复合物。・OH从侧链氨基酸上提出一个氮原子，使侧

3、链氨基酸上的碳上有一个不配对电子。在此不配对电子作用下，铁(III)一蛋口质配位复合物乂重新变回铁(II)一蛋口质配位复合物，随后配位键断开，二价铁离子和NIV与复合物分离，由此在蛋白质侧链形成拨基或拨基衍生物。蛋白质屮的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸残基都有可能参与蕨基化。蛋白煤基含量检测试剂盒是一种现代条件下检测蛋白锁基含量的快捷手段。对简便灵敏的检测各种器官、血清、培养细胞和细胞器等蛋口质拨基含量。其使用不需要昂贵的设备，样胡处理简单，可广泛应用于各种疾病如衰老、动脉硬化症、糖丿永病和帕金森综合症、风湿性关节炎等疾病

4、的早期诊疗，抗氧化保健食品、抗氧化药物和化妆品的评价，还可以用于评价由于一些环境有害因子如辐射、化学毒物等对机体造成的氧化损伤。本实验涉及的蛋白质碳基含量测定数学公式，如下：蛋白质拨基含量(nmol/mgprot)=22x比色驚蔦囂蠡爲蛋白含量的测定：蛋白质分子具有NH?+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准样液或样品中时，考马斯亮兰上的阴离子与蛋口上的NHs+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算蛋口含量：蛋口含量(0L)二x标准管浓度0L测定管OD值-空口管OD值标准管OD值-空白管OD值实验器材1.实验对

5、象：8周龄小鼠2.实验仪器：紫外分光光度计、离心机、微量移液器、电子天平、研钵、烧杯、0.5cm光径石英比色皿、滤纸等3.实验试剂：a.试剂盒组成和配置：试剂一：匀浆介质，无色透明液体，lOOmlX1瓶；4€保存;试剂二：浅砖红色液体，5mlX1瓶；4°C避光保存；试剂三：黄色液体，20mlX1瓶试剂四:无色液体,20mlX1瓶试剂五：无色液体，60mlX1瓶试剂六：无色液体，70mlX1瓶4°C避光保存;4°C保存；4"C保存；4°C保存；a.自备试剂:无水乙醇（分析纯）乙酸乙酯（分析纯）b.无水乙醇乙酸乙酯混合应用液的

6、配置：将无水乙醇和乙酸乙酯按体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。考马斯亮兰贮备液蛋白标准液：O.563g/L四、实验步骤1.组织获取：8周龄小鼠个处死一只，分别取待测组织——肝脏。至于0.9%生理盐水屮，备用。2.组织匀浆的制备：取组织块0.1克，在冰冷的生理盐水中漂洗干净，滤纸拭干，按照重虽:体积比1：9的比例加入试剂一（0.1克的组织中加入0.9ml的试剂一），在冰浴条件下机械匀浆，将匀浆液用离心机3000r/min离心lOmin,取上清即10%匀浆进行测定；3•収10%匀浆450pl,加入50pl试剂二，宗温

7、放置lOmin后，11000i7min离心lOmin,取上清进行蛋口质拨基的测定，同时取部分上清用于考马斯亮蓝试剂盒测定匀浆的蛋口含量；1.以下操作如表一所示:表一上清液的试剂盒操作加入试剂（ml）测定管对照管上清液0.10」试剂-0.4试剂四0.4漩涡混匀lmin,37°C准确避光反应30min试剂五1.01.0漩涡混匀lmim在4°C以12000r/m离心10min,弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀1min,在4°C下，以12000r/m离心lOmin,弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液L

8、01.0漩涡混匀lmin,在4°C下,以12000r/m离心1Omin,弃上清液,留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀lmin,在4°C下,以12000r/m离心lOmin,弃上清液,留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀lmim在4°C下，以12000r/m离心lOmin,弃上清