拟除虫菊酯噬菌体抗体库构建及基因工程抗体制备

《拟除虫菊酯噬菌体抗体库构建及基因工程抗体制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据分类号：TS201．6密级：(秘密、机密、绝密)学校代码：10057研究生学号：11813008拟除虫菊酯噬菌体抗体库构建及基因工程抗体制备ConstructionofPhageAntibodyLibrarySpecificforPyrethroidsandPreparationofGeneticallyEngineeredAntibody专业名称：营养与食品一生学指导教师姓名：杜欣军教授研究生姓名：常继辰申请学位类别：医学硕士论文提交日期：2014年3月论文课题来源：国家自然科学基金项目学位授予单位：天津科技大学万方数据天津

2、科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：珲通融日期：№却年}月v)日知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人

3、，知识产权单位属天津科技大学：所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：晦稚同期：埘年。调--)日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容，允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、

4、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密il(请在方框内打“√”)，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于作者签名：导师签名：秽请在方框内≮黧。沙坩年p月_：；7日荆喀日期：Ⅵ14年-月≯1日万方数据摘要抗体作为免疫分析的核心试剂，其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析中应用的瓶颈因素，因此寻求一种新的抗体制备方法对农残免疫分析具有重要的意义。本研究利用噬菌体抗体库技术和基因工程技术，制备了拟除虫菊酯单链抗体，并对抗体的结构特点及其与抗原的特异性作用进行了分析。首先，从分泌拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G2E7中提取

5、总RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，利用兼并引物进行PCR扩增，获得了长度约350bp的重链可变区基因和约325bp的轻链可变区基因，再经重叠延伸PCR获得了750bp左右的单链抗体(scFv)基因。经过内切酶蹄I和Not1对scFv和pCANTAB5E载体进行酶切、连接和热激法转化大肠杆菌TGt，最终获得了库容大小2．3×107的拟除虫菊酯初级抗体库，阳性率为100％。利用抗原对抗体库进行淘选，通过五轮淘选，有效地富集了拟除虫菊酯特异性噬菌体抗体，第五轮淘选后的噬菌体阳性率为95％；随机挑取五轮淘选后的单克隆进行测序，得

6、到3个scFv基因。将3个基因进行PCR扩增、EcoRI和XhoI酶切后，与pET．26b载体进行连接，成功构建重组表达载体scFv—pET26b。将重组质粒转入表达菌株BL21，最终得到3个scFv．pET26b重组表达菌株。对表达条件进行优化，经超声破碎及SDS．PAGE检测，结果显示在0．1mMIPTG，200rpm，25℃低温诱导12h条件下，3个scFv蛋白能成功表达，重组蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞内，少量以可溶形式存在。利用间接竞争ELISA初步鉴定3个scFv的活性，结果表明：拟除虫菊酯2号单链抗体(PBAscFv

7、2)对氰戊菊酯具有一定的结合活性，10lag／mL标品浓度下抑制率约为20％。序列分析结果显示PBAscFv2蛋白共245个氨基酸，重链123个氨基酸，轻链107个氨基酸，柔性连接肽15个氨基酸；经SOPMA软件分析，PBAscFv2二级结构中含13,螺旋2l处，B折叠109处，p转角23处，随机卷曲92处；利用CPHmodels3．2Server对PBAscFv2的空间结构进行模拟，并利用DiscoveryStudio2．5软件将PBAscFv2与氰戊菊酯分子进行对接，结果显示抗原抗体结合区域由三部分构成：①抗体重链高可变区CDR3

8、区ⅣH．CDR3)残基Metl06、Aspl07、Tyrl08和Trpl09；②轻链框架llI区(vL．ERa)残基Tllr91和Ser92；③轻链高可变区CDR2区rVL．CDR2)残基Ala4l、Ser42和Pr04