atpase域调节结核分枝杆菌螺旋酶gyrb与gyra的相互作用

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1、华中农业大学硕士学位论文ATPase域调节结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA的相互作用姓名：刘政申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：陈焕春；黄友谊201206结核分枝杆菌螺旋酶6ym-与GyrA市目互作用核心区域的研究摘要DNA螺旋酶是一种类型II的拓扑异构酶，它是唯一的能够能够向DNA链中引入负超螺旋的拓扑异构酶，这一过程是需要ATP水解的能量。螺旋酶存在于细菌体内，但是人体内不含有此种酶，所以成了很多药物的靶标，比如临床上应用比较广泛的喹诺酮药物。但是关于GyrA矛1]GyrB之间的具体的作用

2、区域或者是位点还没有人进行研究，本人所在的课题组借助前人的关于螺旋酶的作用的模型已经把相互作用的范围缩小在GyrB的Toprim结构域。我们本课题就是基于这个基础提出的，我们通过对GyrB的ATPase域进行逐步的截短，然后通过酵母双杂交技术进行验证阶截短的G”B能够和GyrA发生相互作用，并利用X-gal显色的方法证明两者之间的结合能力的大小，并进行两者之间的亲和力和结合常数的大小，并通过一定的手段来测定截短I拘GyrB以及重组酶相对于野生型的构象的变化本课题的目的是想得GyrBI拘ATPase结构域在G

3、yrA和GyrB之间的相互作用中起的作用以及这个结构域是通过何种方式来影响两者之间的相互作用的。能够为治疗结核病的药物的开发提供一定的理论基础本课题的主要研究结果为：1、依据gyrB基因序列，扩增突变体片段gyrB79．714、gyrBl83．714、gyrBza79．182、gyrBA294—465；将扩增的片段分别与表达载体pET28a和酵母载体pGADT7相构建；并进行蛋白纯化；2、酵母双杂交、SPR等实验结果证明：ATPase、Transducer是调节GyrA和GyrB相互作用的重要区域。3、圆二

4、色谱实验结果显示，当ATPase和lTransducer区域被缺失掉以后，与野生型GyrB相比较，突变体的二级结构发生了很大改变。证明这两个区域对于维持GyrBl拘结构稳定起着很重要的作用关键词：结核分枝杆菌螺旋酶；酵母双杂交；缺失突变体；ATPase华中农业大学2012届硕士研究生学位论文Abs仃actDNAgyraseisoneoftheToposomeraseii．Indeed，weallknownowthatgyraseistheonlyenzymeabletointroducenegativesu

5、percoilsintoDNA，usingtheenergyofATPhydrolysis．Gyraseareubiquitousamongbacterias，butuntilnowthereisnoevidenceshowitexistsinhumancells．SoitCallbeexploitedasatargetformanydrugs，likethequinolonewhichisusedcommonintheclinicalapplication．Thereisnoresearchontheex

6、actdomainwhereGyrAinteract、ⅣitllGyrB．OurteamhaddosomeexperimentstomakesurethetoprimisthedomainthatGyrAinteract、析mGym，however,weaslofindtheATPasemaybemediatetheinteraction．Soonthisbasis，weconstructedseveraltnmcatedmutantswhichwasbasedonthestructureofMtbGyrB

7、：gyrB79—714,gyrBl83-714，gyrBA79一J82,gyrBA294—465．ThenweuesedYeasttwo-hybridsystemtoprovetheinteractionbetweenGyrAandGyrBmutants．ThroughSPRexperimentwetestthevalueofaffinityandtherateconstant．WitlltheCDexperimentweacquirethediffterenceofthesecondarystructur

8、ebetweentheGyrBanditsmustants．ThissubjectaimstounderstandtheroleofATPaseintheinteractionbetweenGyrAandGyrB，andhowthisdomainaffecttheinteraction．wehopeOurworkcallcontrbutetoexploitnewdrugs．ThemainresultsofOure