mptp介导细胞凋亡在糖尿病家兔骨骼肌病变中的实验分析

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1、贵阳医学院2014届硕士研究生论文前言骨骼肌是餐后胰岛素刺激下葡萄糖摄取的主要部位，如其在数量、形态及功能等任何方面改变都可能从胰岛素剥夺或胰岛素抵抗方面来影响体内葡萄糖的[1]生理平衡功能，同时，骨骼肌又是糖尿病损害的主要靶位。糖尿病骨骼肌病是糖尿病慢性并发症之一，临床主要表现为肌无力、肌肉酸痛、肌肉缺血、萎缩、[2]梗塞、坏疽等。糖尿病骨骼肌病常常因早期症状不明显而被忽视,导致治疗的延误,患者的生活质量严重受影响。故研究骨骼肌在糖尿病状态下的各种病理生理机制，有助于寻找防治糖尿病骨骼肌病的有效途径和方法。糖

2、尿病骨骼肌病变的发病机制主要涉及血管性因素、神经性因素、代谢性因[3-4]素和细胞凋亡途径等方面，国内有研究发现在糖尿病肌组织中，细胞凋亡相关分子Fas／Fasl和caspase-3呈阳性表达，且骨骼肌电镜下的形态改变与细胞凋亡的早期改变相一致，提示细胞凋亡通路可能参与了骨骼肌病变。目前，细胞凋亡通路的活化对糖尿病肌病的潜在作用，很少有文献报道。细胞凋亡途径主要有[5]外源性途径和内源性途径，而线粒体为内源性凋亡途径的中心。线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitio

3、npore，mPTP)在线粒体介导的细胞凋亡途径中起重要作用。mPTP是横跨于线粒体内外膜之间的非选择性通道，但其确切组成结构目前尚不明确。线粒体外膜上存在许多Bcl-2家[6-7]族蛋白，可调节mPTP的开闭，是调控细胞凋亡通路的一个重要因素。正常生理情况下，mPTP限制性地允许一些小分子物质通过，以维持正常的生理功能。在Ca2+超载、特别是伴有氧化应激、磷酸盐浓度升高和腺嘌呤核苷[8]酸消耗等情况下，mPTP开放，许多相对分子质量≤1.5kDa的物质通过，导致线粒体跨膜电位降低或丧失，呼吸链上电子传递发生障

4、碍，氧化磷酸化失耦联，[9]细胞ATP合成障碍，膜间隙的一些促凋亡因子、蛋白释放人胞质，凋亡因子可导致细胞结构破坏和染色体凝缩，ATP下降导致细胞能量供应崩溃并激活降解[10]酶，最终导致细胞凋亡。近年来国内外有关mPTP介导的细胞凋亡的研究逐6贵阳医学院2014届硕士研究生论文渐增多，但目前还未见mPTP介导的细胞凋亡在糖尿病骨骼肌病中的研究报道。本实验通过建立糖尿病家兔的动物模型，通过对正常家兔和糖尿病不同时期家兔的病理形态学观察、凋亡率检测、Bax/Bcl-2表达情况及mPTP开放程度的对比，来探讨mPT

5、P介导的细胞凋亡在糖尿病骨骼肌病发病机制中的作用，为糖尿病骨骼肌病变的发病机制和治疗方案寻找新的途径，并为其提供理论基础和参考。7贵阳医学院2014届硕士研究生论文材料与方法1.材料1.1实验动物随机选取健康家兔36只，体重为2．0～2．5kg，平均(2．2±0．3)kg，雌雄不分，由贵阳医学院实验动物中心提供，统一喂养。1.2主要试剂礼来中效胰岛素贵州赛兰博试剂公司四氧嘧啶Sigma公司stzSigma公司Bax一抗武汉博士德生物公司Bcl-2一抗武汉博士德生物公司DAB显色试剂盒北京中杉金桥生物公免疫组化试

6、剂盒武汉博士德生物公司Rhodamine123上海杰美基因医药科技有限公司纯化线粒体损伤/氧化（NAO）上海杰美基因医药科技有限荧光测定试剂公司Annexin-V-FITC美国BD公司（Becton,DickinsonandCompany）PropidiumIodideStaining美国BD公司Solution8贵阳医学院2014届硕士研究生论文10XAnnexin-VBinding美国BD公司BufferDMSO贵州顶国生物公司1.3主要仪器FACSCantoⅡ流式细胞仪美国BD公司CantoII透射电镜H

7、itachi日立-7500显微镜Leica公司，德国RM2245型石蜡切片机Leica公司，德国冰冻离心机德国eppendorfcentrifuge5810R1.4需配置的溶液线粒体分离介质：225mmol/l甘露醇8.198g、75mmol/l蔗糖5.134g、20mmol/lHepes0.953g、1mmol/lEDTA0.074g，用Tris-Hcl调PH=7.4,定容至200ml，4℃保[11-12]存备用。线粒体反应介质：230mmol/l甘露醇8.380g、70mmol/l蔗糖4.792g、3mmo

8、l/l[11-12]Hepes0.143g，用Tris-Hcl调PH=7.4，定容至200ml，4℃保存备用。2.方法2.1糖尿病兔模型建立选用36只健康家兔，随机选取7只为对照组（I组），29只为实验组。所有动物在现有的条件（环境、温湿度、饲料等）下饲养一周以上，动物房每天清洁两次，保持通风换气。用0.05mmol/l枸橼酸滴定生理盐水至PH值为4.0-4.3之间，行高压灭菌，用无菌