西洛他唑对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与对bcl-2蛋白表达的影响

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描

2、等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文前言由各种原因（如脑梗塞、外伤）引起的暂时性或永久性脑血管血流减少导致的脑缺血性损伤是引起人类死亡或肢体功能丧失的主要原因。脑的缺血损伤涉及多个不同的机制作用，如兴奋性氨基酸的过度释放、自由基机制、钙离子超载等。有证据表明当脑血管血流恢复时可以产生活性氧和活性氮，加重脑缺血损伤。动物脑缺血再灌注损伤模型对研究人类各种原因脑缺血损伤的损伤机制和治疗方法有重要的理论及实际意义。西

3、洛他唑是一种选择性磷酸二脂酶3抑制剂(Inhibitorofcyclicnucleotidephosphodiesterase3，PDE3)，分子式为C20H27N5O2，分子量为349.47，以白色、黄白色晶体或晶体粉末存在。血管内的西洛他唑与血浆蛋白的结合率约为95%，而且大多14【1】【2】是以比较稳定的C-cilostazol形态存在。西洛他唑具有广谱的药理学活性，对于【3】很多疾病，如外周血栓疾病和间歇性跛行等都有临床价值。而且西洛他唑具有抗血小板、舒张血管和抗恶性细胞增生的功能，从而可以起到防止循环性休克和冠状动脉【4】狭窄再发生的作用。研究表明PDE3可以抑

4、制循环系统内cAMP的降解，并增加血小板和血管平滑肌中的cAMP，对血小板的形成有抑制作用并且有促进血管平滑肌细【5】胞增生的作用。西洛他唑主要通过影响下列各种因素抑制血小板降解：花生四烯酸、【6】二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原蛋白、纤维蛋白酶。现在已经有专家认为可以对颈动【7】脉血栓的患者建议行西洛他唑治疗，可以治疗或预防脑缺血。同时PDE3可以抑制一氧化氮合成酶（NOS）的生成，从而减少一氧化氮（NO）的产生。Nakamura等人的研究发现西洛他唑可以作用于血管内皮组织，而软化保护猪的胸主动脉，并认为这【8】可能与血管中NO水平有密切的关系。除上诉作用之外西洛他唑还可以增

5、加血管中细胞生长因子的含量，可以改善血管平滑肌细胞损伤刺激后的不规则生长，而且通过【9】加速内皮细胞的新陈代谢来调节内皮细胞的功能紊乱。目前针对脑缺血性损伤的基【5】本治疗策略主要有以下几个：抗血小板、抗凝、溶栓、神经保护。脑缺血再灌注损伤引起的神经细胞死亡方式有三种：坏死、自噬和凋亡。Bcl-2基因家族诱导形成的多种蛋白在神经细胞凋亡中起重要作用，bcl-2蛋白有抑制神经细胞凋亡的作用，而Bax蛋白有促进神经细胞凋亡的作用。3华中科技大学硕士学位论文（西洛他唑化学结构）本实验采用改良线栓法制作小鼠脑缺血再灌注损伤模型，线栓栓塞大脑中动脉造成脑缺血30min，再灌注24h

6、后处死取材。通过TTC染色、HE染色、NOS活力、western检测结果的比较，研究选择性磷酸二脂酶3抑制剂西洛他唑对脑缺血再灌注损伤的神经细胞损伤程度的影响，以及对bcl-2蛋白表达水平的影响。4华中科技大学硕士学位论文材料和方法1材料及器械1.1仪器设备：显微照相系统；石蜡切片机；微波炉；微量注射器；手术显微镜；-80度冰箱；恒温水浴箱；分光光度计；手术显微镜1.2主要试剂：鼠抗bcl-2抗体；羊抗鼠β-action抗体；抗体稀释液；TTC；裂解液；NOS试剂盒；多聚甲醛；2.5%戊二醛；6%水合氯醛。2实验方法2.1动物模型制备：30只雄性清洁小鼠，小鼠体重在26-

7、30g范围。随机分为假手术组（10只）、模型组（10只）、西洛他唑组（10只）。对假手术组老鼠给予一侧颈外侧动脉结扎后，不给予任何处理后关闭切口。脑缺血再灌注损伤模型采用以下方法制作：腹腔内注入水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，手术台仰卧位，固定其四肢及头部，切开颈部皮肤，手术显微镜下分离出颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA),结扎ECA及其分支，沿ICA向前向下分离翼腭动脉,在ICA起始部置一动脉夹备用,分离与颈总动脉伴行的迷走神经，用微小动脉夹夹闭远端的颈总动脉,在距颈总动脉分叉处近端结扎颈外动脉。