荧光微菌落快速检测的基本步骤

《荧光微菌落快速检测的基本步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、荧光微菌落快速检测的基本步骤1.材料和方法1.1主要材料***MRS培养基（英国OXOID公司）或NBB-A培养基***CFDA（羧基荧光素二醋酸酯，德国SIGMA公司）25mg包装CFDA说明：6-羧基二乙酸荧光素(6-cfda) :6-carboxy-fluorescei-diacetate生产厂家： sigma 货号：c5041 说明：可用于从凋亡细胞中区分出有活性的细胞分子式：C25H16O9；分子量：460.39CAS#：3348-03-6特性：纯度：95%（HPLC）溶解性：溶于DMSO或丙酮储存条件：-20℃注意：荧光素在不同的条件下会发生淬灭，因此建议买25mg包装即可，使用时

2、先配成1000PPM母液，分装每管100μL，使用时取用1管。1.2仪器和设备厌氧罐（英国OXOID公司），厌氧产气袋（英国OXOID公司），厌氧指示片（英国OXOID公司），荧光显微镜（奥林巴斯BX41），pH计，生化培养箱，抽滤系统（美国pall公司），醋酸纤维膜（孔径0.45μm，直径47mm，德国沙多利斯公司）和聚碳酸酯膜（孔径0.45μm，直径47mm，美国millspore公司）。醋酸纤维膜（孔径0.45μm，直径47mm，德国沙多利斯公司或pall公司）：聚碳酸酯膜（孔径0.45μm，直径47mm，美国millspore公司）：1.3主要试剂的配制***PBS缓冲液：称取Na2H

3、PO4﹒12H2O2.902g、NaH2PO4﹒2H2O0.296g、NaCL10g,定容100mL，调节pH值为7.4。现用现配，配后用0.2μ膜过滤备用（针筒式过滤头——厂家：津腾，材质：尼龙66）。***CFDA母液(10000ppm)：称取25mg溶解于2.5mL丙酮中，制成10000ppm母液冷冻保存(-20℃)备用。***染色液（100ppm）：吸取CFDA母液100μL,加入9.9mLPBS缓冲液,将染色液稀释为100ppm,避光暂存（4℃）。1.3样品培养使用黑色膜片（赛多利斯和颇尔的黑膜都可以用）无菌过滤样品100mL（可根据样品污染程度调整过滤量，使用无菌水进行定量稀释），

4、而后取出滤膜光面向上贴于已备好的平板计数琼脂平板（培养菌落总数）MRS琼脂平板上（用于培养厌氧菌。另：NBB-A也可用，但是导致成本提高）。过滤后平板计数琼脂平板放入360C培养箱培养6h，MRS琼脂平板放入厌氧罐中于280C厌氧培养30～36h。1.4荧光染色A、配制染色液：称取Na2HPO4﹒12H2O2.902g、NaH2PO4﹒2H2O0.296g、NaCL10g,定容100mL，调节pH值为7.4（避光保存），使用时用0.2μ膜过滤，吸取9.9mL到无菌烧杯中，再吸取0.1mLCFDA母液，充分混合后在烧杯内壁放入一适当大小的无菌滤纸将染色液全部吸入（现用现配）。B、荧光染色：6h将

5、好氧培养好的膜片，30～36h将厌氧培养好的膜片放入染色烧杯中的滤纸上进行染色，避光染色15min，此时打开荧光显微镜电源进行预热15min。15min后取出膜片放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗涤2—3次，以洗去膜片下面多余的染色液。放至载玻片上(如果使用黑膜片则可以直接放在载玻片上观察)。将载玻片置于接通蓝色激发块(450-490nm)的通路中，在4×或10×下观察计数，手动扫描整个膜片，直接计数出过滤后膜片上的菌落数。1.5注意事项：A、PBS缓冲液需现配现用，避光保存，避免pH引起变化影响结果观察。B、短时间染色液低温避光保存可以连续使用观察好养和厌氧菌。