芦笋花药培养与再生植株性别分子标记鉴定

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1、河北农业大学硕士学位论文芦笋花药培养与再生植株性别分子标记鉴定姓名：陈海媛申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：乜兰春20120602摘要llUllI)1111HIIIIIJJllllllllllIHIY2143690芦笋(Asparagusoj够cinalis．Lima)学名石刁柏，以嫩茎供食，具有极高的营养保健价值，有防癌、抗癌，预防和治疗高血压、心脏病等功效，是国际公认的抗癌食品，享有“蔬菜之王”的美誉。我国虽已成为世界芦笋生产与出口的大国，但我国芦笋生产用种主要依靠进口，缺乏自主知识产权的优良品种成为制约我国芦

2、笋产业发展的瓶颈。芦笋是雌雄异株植物，性别由一对等位基因控制，雄性基因型为Mm，雌性基因型为mm，基因型为MM的雄株为超雄株。雄株具有生长旺盛、品质好、产量高、寿命长、抗病性强等特点，因此培育全雄品种成为国内外芦笋育种的主要方向，而培育全雄品种的关键是获得超雄株(MM)。花药培养是获得超雄株的简单且有效的途径。本试验以当前生产中表现较好的4个优良品种为试材，研究了季节、预处理、NAA及6．BA等因子，对芦笋花药培养形成愈伤组织的影响，建立了‘阿波罗’、‘冠军’以及‘NJ987’三个优良品种的花药培养技术体系，并利用分子标

3、记技术对再生植株进行了性别鉴定。主要研究结果如下：1．芦笋花药培养愈伤组织的诱导：(1)季节影响芦笋花药愈伤组织的诱导，每年5月份采集的花药均能诱导形成愈伤组织，而7月与9月采集的花药未能诱导出愈伤组织。(2)当花蕾长度为1．2mm时，花药愈伤组织诱导率最高；花蕾长度为2—3mm、3-4mm时，愈伤组织诱导率降低；花蕾长度为4mm以上时，未能诱导出愈伤组织。(3)不同品种对低温预处理的要求不同，在4"C低温下，‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’花药处理5d，愈伤组织诱导率最高；而‘格兰蒂’花药处理3d，愈伤组织诱导率最

4、高。(4)芦笋花药愈伤组织诱导形成的条件存在基因型差异，‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’在MS+2．0mg／L6．BA+I．0mg／LNAA条件下愈伤组织诱导率最高，且能自然分化成芽；而‘格兰蒂’在MS+2．0mg／L6一BA+I．25mg／LNAA，愈伤组织诱导率最高，但未分化成芽，对其愈伤组织进行再分化处理，未得到再生植株。2．‘阿波罗’、‘冠军’和‘NJ987’的再生植株最适继代增殖条件为：MS+0．5mg／L6一BA+0．2mg／LNAA。3．芦笋花药培养再生植株染色体倍性呈多样性。本试验对142株‘阿波罗’

5、和341株‘NJ987’进行倍性鉴定，其中‘阿波罗’再生植株染色体数目为单倍体的占4．93％，二倍体占30．99％，三倍体占24．65％，四倍体占15．49％，非整倍体占23．94％；而‘NJ987’的再生植株染色体数目为单倍体的占2．64％，二倍体占78．89％，三倍体占7．04％，四倍体占4．99％，非整倍体占6．45％。4．芦笋再生植株性别的鉴定：(1)本试验优化了鉴定芦笋性别的STS标记体系，最佳PCR体系为20pL：总DNA提取液3肛L，10xPCRBuffer(MgCl2)29L，dNTP(2．5mM)O．8

6、pL，TaqDNA酶(5U／I_tL)0．249L，Aspl—T7．Pc(10U／lxL)0．29L，Aspl．T7．Ph(10U／gL)0．21aL，MgCl2(25mM)0．4pL，ddH2013．161xL；反应程序为：94。C预变性30s；94。C变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。(2)本试验利用Aspl．T7标记对芦笋花药培养产生的370个再生单株进行了检测，其中251株在440bp附近扩增出特异片段，可确定为雄性株(MM、Mm、M)。其中‘阿波罗’品种

7、的花药再生雄株为148株，‘NJ987’品种的花药再生雄株为103株。关键词：芦笋；花药培养；再生植株；分子标记；性别鉴定TechnologyofasparagusofficinalisL．anthercultureandsexidentificationofplantregenerationbymolecularmarkersAH匝DcChertHai-yuanMajor：OlericultureSupervisor：．NieLan-ehunAbstractAsparagusasallinternationallyre

8、cognizedanti—cancel"food，Wascalled“KingofVegetable”intheworldbecauseofitsnutritionalvalue，theefficacyofanti-cancel-，preventionandtreatmentofhighbloodpressurean