免疫蛋白质组学法鉴定烟曲霉免疫优势抗原及其在侵袭性曲霉病早期诊断中的应用

《免疫蛋白质组学法鉴定烟曲霉免疫优势抗原及其在侵袭性曲霉病早期诊断中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、江苏大学博士学位论文免疫蛋白质组学法鉴定烟曲霉免疫优势抗原及其在侵袭性曲霉病早期诊断中的应用姓名：史利宁申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：邵世和20120607江苏大学博士学位论文·中文摘要背景近年来，侵袭性曲霉病(invasiveaspergillosis，IA)已成为中性粒细胞缺乏症患者重要的死亡原因之一，而且在非中性粒细胞缺乏症患者如ICU危重患者甚至免疫功能正常的患者，队的发病率亦逐年上升。由于缺乏特异性临床症状和体征，传统的诊断方法如组织病理学检查和真菌培养在感染早期阶段缺乏敏感性，因此认的

2、诊断仍困难，常常到疾病晚期才能诊断或死亡后由尸解获得。目前诊断n最有价值的实验是检测曲霉细胞壁半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)的GM实验。然而，GM实验的敏感性和特异性尚不能满足临床需求。因此，迫切需要研究发现在感染患者血液或其他体液中出现的真菌抗原，以筛选更敏感、更准确的疾病标志物用于认的早期诊断。在前期研究中，我们发现确诊认患者血清中常存在高滴度抗曲霉抗体，这一发现促使我们进一步深入研究能用于诊断IA的新的诊断标志物。目的应用免疫蛋白质组学方法筛选鉴定烟曲霉免疫优势抗原；应用分子克隆和原核表达技

3、术，获得烟曲霉新的免疫优势抗原硫氧还蛋白还原酶GliT(TR)的全长重组蛋白；以重组烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT抗原为包被抗原，建立测定人血清中抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT抗体的ELISA法；用认家兔模型，考察实验动物产生特异性anti—TR抗体应答的情况；通过检测临床血样本评估该法在侵袭性曲霉病诊治中的应用价值。方法TCA／丙酮沉淀法制备烟曲霉分泌蛋白及菌体蛋白质，用确诊IA患者血清与烟曲霉分泌蛋白及菌体蛋白质进行免疫印迹，筛选免疫反应最强的蛋白质。筛选出的免疫反应最强的烟曲霉分泌蛋白质进_步用二维电泳来分

4、离，并用混合确诊患者血清进行免疫印迹。从2-DE胶上切下有免疫反应的蛋白质点进行胶内酶切以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI．TOF．MS)分析获得肽质量指纹图谱，然后利用Mascot查询软件搜索NCBI数据库鉴定蛋白质。对免疫反应最强的优势抗原烟曲霉喇行生物信息学分析。用SignalP软件预测该蛋白质是否有信号肽，用WoLFPSORT预测其亚细胞定位，并用BLAST程序进行同源性分析。用RT-PCR，从烟曲霉总I斟A中扩增出TRcDNA片段，克隆至pMDl8．喊体，并转化EcoliJMl09。经序列分

5、析证实后，提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因，与表达载体pET28a(+)连接，转化EcoliBL21(DE3)，筛选重组表达质粒。用异丙基硫代一p-D一半乳糖苷(PTG)诱导重组融合蛋白表达，用SDS．PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白，亲I免疫蛋白质组学法鉴定烟曲霉免疫优势抗原及其在认早期诊断中的应用和层析柱纯化重组蛋白。新西兰白兔注射可的松造模，静脉注射烟曲霉分生孢子，建立认动物模型。以重组烟曲霉TR为包被抗原，建立检钡KJanti．TR抗体的间接ELISA法，并观察队家兔模型血清中anti．碱体产生的情况。收

6、集经组织病理学检查和／或真菌培养证实的各类认患者血清，以健康体检者、无认但血培养为其他真菌及细菌的患者血清为对照，用ELISA法测定血清中的anti．1R水平，确定cutoff值并对方法的敏感性和特异性进行考察。结果(1)烟曲霉分泌蛋白质的免疫反应性在反应强度及反应数量上均优于菌体蛋白质。在4种不同培养基的分泌蛋白质中，用YEPG培养烟曲霉14d的分泌蛋白质的免疫反应性最强，有免疫反应的蛋白质条带数量最多，拟用于免疫蛋白质组学分析，进一步筛选特异性烟曲霉抗原。(2)烟曲霉分泌蛋白质的免疫蛋白质组学分析结果显示，确诊

7、认患者血清与分泌蛋白质中多种抗原反应强烈。40个蛋白质点被抗体阳性IA患者血清识别。对40个蛋白质点质谱分析，成功鉴定了39个免疫反应阳性的蛋白质点，代表17种蛋白质。多．数鉴定蛋白质为参与碳水化合物、脂肪酸、氨基酸和能量代谢的代谢酶。在鉴定出的17种蛋白质中，已知有7种蛋白质为曲霉或其他真菌抗原，有10种为新发现的有免疫原性的蛋白质，如延胡索酰乙酰乙酸水解酶FahA、醛脱氢酶AldA、芳香基氨基转移酶Ar08、G．蛋白复合物p亚基CpcB、肌动蛋白细胞骨架蛋白CcIP：)、phytanoyl．CoA一--氧化酶家

8、族、尿酸氧化酶UaZ、3一羟丁酰辅酶A脱氢酶、蛋白酶体组分Prc8和假想蛋白。有7种免疫原性蛋白显示有多个蛋白质点。令我们感兴趣的一个免疫反应最强的蛋白质，鉴定为硫氧还蛋白还原酶GliT(TR)。(3)用SignalP软件预测结果显示TR带有信号肽(signalPprobability,O．808)；WoLFPSORT软件预测结果显示TR为胞外蛋白质(Que