大豆抗原蛋白对仔猪的致敏性和免疫原性的研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文大豆抗原蛋白对仔猪的致敏性和免疫原性的研究姓名：孙志阔申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：吴金节201206中文摘要大豆中存在的大豆抗原蛋白物质，会引起畜禽尤其是幼龄动物产生过敏反应，发生腹泻甚至死亡，给畜禽业造成巨大的经济损失。本试验通过研究大豆球蛋白(11S)、p．伴球蛋白(7S)对小鼠和仔猪的致敏性和免疫原性，探讨大豆过敏性疾病的早期诊断和防治方法及作用机理。，大豆抗原蛋白的纯化及注射液的制备。经琼脂糖凝胶层析对11S、7S抗原蛋白进行纯化，再透析及冷冻干燥。采用SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化的

2、11s、7S蛋白进行检测和分析。应用光密度法分析电泳图片，并计算其纯度。选用不同佐剂(弗氏佐剂、白油佐剂、氢氧化铝胶体佐剂、PBS佐剂、蜂胶佐剂)与大豆抗原蛋白充分乳化，并进行无菌和安全性检验。大豆抗原蛋白对小鼠致敏性的研究及酶联免疫吸附试验法的建立。试验选取510只昆明鼠，将其随机分为对照组、弗氏佐剂处理组I(7S)和处理组II(11S)、白油佐剂处理组I(7S)和处理组II(11S)、氢氧化铝佐剂处理组I(7S)和处理组II(11S)、PBS佐剂处理组I(7S)和处理组II(1lS)、蜂胶佐剂处理组I(7S)和处理组II(11S)，

3、对照组10只，各处理组50只；对照组注射生理盐水，处理组使用不同佐剂大豆抗原蛋白注射液；每个处理组再随机分为5组，每组10只，每组注射大豆抗原蛋白量分另0为500pg。K91、1000pg·K矿1、2000pg·K91、3000pg·K百1和4000pg·K分1。首次免疫，取混合乳化后的大豆抗原蛋白，于小鼠颈背部皮下注射。10d后，同样方法注射相应抗原组分(弗氏完全佐剂抗原蛋白注射液替换为弗氏不完全佐剂抗原蛋白注射液)，连续lOd后重复1次。第三次注射完成10d后采血、分离血清，采用琼脂糖凝胶扩散试验测定抗体效价；建立大豆抗原蛋白抗体的

4、间接ELISA检测方法，确定7S蛋白和11S蛋白的免疫剂量、次数及免疫效果。大豆抗原蛋白对仔猪致敏性和免疫原性研究。试验选取70头18日龄仔猪，将其随机分为对照组，7S和1lS致敏组，7S和11S免疫组，7S和11S处理组，共7组，每组10头。在仔猪18、28日龄时，免疫组和处理组分别按体重1mg·KgJ注射7S、11S蛋白；28～34日龄和39~41日龄时，致敏组和处理组，每组在基础日粮中分别添加4％的7S、11S蛋白；28、38日龄时，采用琼脂糖凝胶扩散试验测定抗体效价；46日龄进行皮肤试敏试验：68日龄试验结束。采用生化、ELIS

5、A法检测仔猪在不同采血时间点(28、38、48、58、68d)血清中IgG、IgG亚类的含量。探讨大豆抗原蛋白致敏及免疫仔猪后血清中免疫球蛋白IgG、IgG亚类含量的消长规律。试验结果如下：1．经琼脂糖凝胶层析分别得到纯化的11S、7S蛋白，其纯度分别为90．6％、90．0％。大豆抗原蛋白注射液经过无菌检验、肌肉刺激试验发现培养基无细菌生长，对家兔腿部肌肉观察，其肌肉完整、无充血现象。试验结果表明，大豆抗原蛋白经肌肉给药无刺激性反应，安全度较高。2．免疫小鼠血清中的抗体效价均为1：16。通过酶联免疫吸附试验方阵滴定法确定11S蛋白最佳包

6、被浓度为5．O烬·mL-1，血清稀释倍数为1：800；7S蛋白抗原最佳包被浓度为2．5“g·mL～，血清稀释倍数为1：1600；两者的批内、批间系数均小于10％，重复性较好，通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次，免疫剂量为l000“g·K季1。7S和1lS的最佳免疫佐剂分别为氢氧化铝和白油。3．仔猪28日龄时血清效价较低，38日龄时的血清抗体效价均为1：16以上，表明7S和11S均对仔猪产生免疫反应；39．41日龄时仔猪致敏后出现轻度腹泻症状；皮肤致敏试验显示，7S或11S抗原蛋白致敏组注射点皮肤反应均较明显，评判结

7、果均在“+”级以上，表明仔猪皮肤红斑反应呈不同程度的阳性反应，通过皮肤试敏红斑直径大小，证明大豆抗原蛋白对46天仔猪产生过敏反应。但处理组11S或7S注射点比致敏组反应较轻，说明免疫后再致敏能降低过敏反应。4．大豆抗原蛋白对仔猪过敏后可引起血清中垮Gl、IgG2、IgG4含量显著升高，11S致敏后引起总IgG变化不显著，IgG4含量水平在整个免疫及致敏过程均显著增加，可能是过敏反应主要参与者。免疫后再次致敏，能明显降低IgG及IgG亚类含量水平，降低过敏反应的发生，起到了免疫保护效果。试验结果表明，试验得到高度纯化大豆抗原蛋白用于小鼠、

8、仔猪的致敏和免疫，建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法，利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体效价水平，得出小鼠免疫7S蛋白和11S蛋白的最适免疫剂量为1mg·K91，免疫次数为2次，最佳免疫佐剂分别