参与柿单宁代谢的myb、bhlh及wd40转录因子基因的克隆及分析

《参与柿单宁代谢的myb、bhlh及wd40转录因子基因的克隆及分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中农业大学博士学位论文参与柿单宁代谢的MYB、bHLH及WD40转录因子基因的克隆及分析姓名：宿福园申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：罗正荣201206参与柿单宁代谢调控的MYB、bHLH及WD40转录因子的克隆及分析摘要柿(DiospyroskakiThunb．)原产于中国，栽培面积和产量均居世界第一，但传统产区多为涩柿，人工脱涩处理耗费大量人力、物力和财力。柿果呈现涩感是因其果肉中单宁细胞的液胞内含有大量的原花青素(Proanthocyanidins，PAs；也称缩合单宁，condensedtan

2、nin)之故。单宁作为类黄酮代谢途径的终产物之一，其生成途径有众多结构基因参与，而结构基因的表达又受转录因子调控。已有研究表明，MYB、basicHelix．Loop—Helix(bHLH)和WD40三类转录因子构成MBW复合体，共同调控单宁的代谢途径。但中国原产完全甜柿自然脱涩是否与上述转录因子有关目前尚不清楚。本研究以中国原产完全甜柿‘罗田甜柿’为主要研究试材，分离克隆了MYB、bHLH和WD40三类转录因子，开展了柿单宁代谢调控相关研究工作。具体研究结果如下。1．发育期柿果实单宁含量测定。在花后5周，供

3、试材料中单位果重内可溶性与不溶性单宁含量均最高，并随果实发育而逐渐减少，到花后13周，‘前川次郎’(日本原产完全甜柿)和‘西村早生’(日本原产不完全甜柿)果实已完成脱涩，而‘罗田甜柿’(中国原产完全甜柿)果实在花后21周后脱涩，‘磨盘柿’(中国原产完全涩柿)不能在树上完成脱涩。‘前川次郎’和‘西村早生’单果的单宁含量在果实发育早期停止增长，而‘罗田甜柿’和‘磨盘柿’的单宁累积持续到果实发育后期。2．‘罗田甜柿’乙醇脱涩处理后单宁含量变化。花后17周，对‘罗田甜柿’进行离体35％乙醇脱涩处理，处理两天后，果实脱

4、涩，可以观察到单宁细胞颜色明显加深，果实中可溶性单宁含量显著减少，同时不溶性单宁含量相应增加，可溶性单宁转变为不溶性单宁，果实通过“凝固效应”而脱涩。3．柿MYB基因克隆及分析。以拟南芥和葡萄MYB转录因子序列为信息探针，在柿EST数据库中进行BLAST分析，找到一个候选片段DC587740，随后在‘罗田甜柿’中扩增出其片段，通过3’RACE和5’Hi—W讧LPCR扩增得到其全长序列1152bp，其中ORF长843bp，编码290个氨基酸，将该基因命名为DkPAl，序列己提交GenBank。DkPAl具有MY

5、B转录因子的典型结构域，属于R2R3类MYB转录因子，通过邻接法构建进化树，发现其与已报道的其他物种中参与单宁调控MYB转录因子具有极高的序列相似性。DkPAl在‘罗田甜柿’与‘磨盘柿’中的表达模华中农业大学2012届博士学位论文式与两个材料中单宁的累积模式一致，与结构基因DkDHD、DkSCPL、DkF3讯伽百强D翩舰的表达模式也一致。4．柿bI-ILH基因克隆及分析。以拟南芥bHLH转录因子AtTT8为信息探针，检索柿EST数据库，找到一个候选片段DC587220，在‘罗田甜柿’中扩增出其片段，通过3’R

6、ACE和5’Hi—TAILPCR扩增得到其全长序列2687bp，ORF长2160bp，编码719个氨基酸，将该基因命名为DkMYCl，序列已提交GenBank。DkMYCl具有bHLH家族典型的碱性螺旋．环一螺旋结构，属于bHLH转录因子IIIf家族成员，与葡萄和拟南芥中参与单宁代谢调控的bHLH转录因子具有极高的序列相似性。在‘罗田甜柿’、‘前川次郎’和‘磨盘柿’中，DkMYCl的表达模式与三个材料中单宁的累积模式一致，也与DkANR、D鹏百W等结构基因的表达模式一致。在‘罗田甜柿’中分离得到单宁代谢途径两

7、个特异基因DkLAR和DkANR启动子序列，发现在Dk,,tNR的启动子区具有多个bHLH转录因子的关键调控元件MYCATERDl及MYCCoNSENSUSAT，进一步确定其受DkMYCl调控。5．柿WD40基因克隆及分析。通过同源克隆法设计简并引物，在‘罗田甜柿’中扩增出WD40基因片段，通过3’RACE和5’Hi．TAILPCR扩增到全长序列1640bp，ORF全长1014bp，编码337个氨基酸，将该基因命名为DkWD40，序列已提交GenBank。DkWD40具有4个典型WD40结构域，与葡萄VvWD

8、Rl相似性最高。在发育期的果实中，DkWD40的表达与单宁代谢途径中结构基因(D㈣、DkSCPL、D鹏似D鹏j讯D翩帜)的表达并不十分相符，而与单宁凝固基因(D枷DJ琊)相符。在乙醇脱涩处理果实中，DkWD40也与单宁凝固基因表达一致。将DkWD40构建超表达载体打入农杆菌，并侵染拟南芥花序，转基因后的拟南芥种皮颜色为黑褐色。6．组织特异性表达分析。DkPAl、DkMYCl和DkWD40在四种供试材