par4在初级感觉神经元的表达及对trpv1调控机制的研究

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1、泰山医学院硕士学位论文PAR4在初级感觉神经元的表达及对TRPV1调控机制的研究姓名：陈丹申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：王昭金2012-02PAR4在初级感觉神经元的表达及对TI冲V1调控机制的研究研究生：陈丹专业：人体解剖与组织胚胎学导师：王昭金教授中文摘要目的蛋白酶活化受体4(PAR4)为G蛋白偶联受体，参与多种病理生理的过程。最近研究发现PAR4在外周炎症和疼痛调节中具有重要作用。以培养的大鼠背根神经节(DRG)感觉神经元为研究模型，研究PAR4在初级感觉神经元的表达。观

2、察PAR4受体及其活化的细胞内机制，以及与伤害性感觉受体瞬时电位香草酸受体亚型1(TRPVl)之间的相互关系，从而为进一步阐明PAR4参与外周痛信号的调节作用提供实验依据。方法1．以急性分离、培养大鼠的DRG感觉神经元为研究模型，利用免疫荧光的方法结合激光共聚焦显微镜技术，研究PAR4和TRPVl在体外培养的大鼠DRG感觉神经元的表达以及两者的共存。2．Trizol裂解法提取培养的DRG感觉神经元总RNA，用R1__PCR检测PAR4基因的表达以及PAR4激动剂对PAR4和TRPVl基因表达的影响，及

3、PKA信号通道对PAR4表达和PAR4介导TRPVl基因表达的调节作用。3．ⅪPA细胞裂解液提取培养的DRG神经元总蛋白，检测PAR4激动剂对PAR4和TRPVl蛋白表达的影响以及PKA信号通道对PAR4表达和PAR4影响TI冲V1蛋白表达的调节作用。结果1．DRG感觉神经元的分离与培养：年轻雄性Wistar大鼠，体重约1009，急性分离DRG，快速取双侧DRG，消化、吹打，制成细胞悬液，种置于六孔培养板观察不同时间段细胞的数量，大小以及突起的长度。接种于六孔培养板的神经细胞培养4小时作用，倒置显微镜

4、下观察，可见部分神经细胞已贴壁，贴壁的神经细胞为圆形或椭圆形，胞体周围有一圈光晕，尚无突1起。神经元的细胞核位于细胞中央或胞体一侧，核仁明显。接种24小时后，大部分细胞已贴壁，贴壁细胞长出小突起，除单个散布的神经细胞外，常可见几个或多个神经细胞聚在一起，它们向四周发出树枝状突起。培养3．4天的神经细胞的突起逐渐延长增粗，可看到神经细胞的突触交织在一起形成稀疏的网状结构。随着培养时间的延长，神经细胞突起的主干和分枝都明显延长并增粗，神经细胞突起形成的网络结构变得更加稠密，神经细胞胞体逐渐增大。随着培养时

5、间的延长，细胞数量会减少。2．PAR4在DRG神经元的表达：免疫荧光组织化学结合激光共聚焦结果显示，在体外培养的大鼠DRG神经细胞，可见大量的感觉神经元表达PAR4，PAR4阳性神经元数量和形态变化与上述体外培养的DRG神经元类似。培养1天的阳性细胞多为一些中小神经元，直径为11—28微米，也偶可见一些大型神经元表达PAR4，形态呈圆形或椭圆形。培养24小时后，PAR4阳性神经元生长突起出现，培养3．4天DRG神经元可出现PAR4阳性轴突。阳性标记物主要出现在细胞膜、细胞浆，细胞核未见表达。3．PAR

6、4与TRPVl在DRG初级感觉神经元共存：在体外培养的大鼠DRG的神经细胞，培养1天的TRPVl阳性细胞与PAR4阳性细胞相似，可见大量的中、小型TRPVl阳性神经元胞体，形态呈圆形或卵圆形。TI冲V1的阳性物分布于细胞膜、细胞浆，细胞核未见标记。DRG培养24小时后，可见TRPVl阳性的树突和轴突。荧光双标结合激光共聚焦结果显示：体外培养的DRG神经元均可见PAR4／TI强V1双标记。对30个培养孔盖玻片上的DRG细胞计数显示：有65．3％土3．2％f162／248)PAR4阳性神经元表达TI冲V1

7、，同样，TRPVl阳性神经元也表达PAR4，细胞计数有95％士2．4％(162／171)TRPVl阳性神经元表达PAR4。4．AYPGKF—NH2对PAR4在初级感觉神经元表达的影响及细胞内机制(1)PAR4激动剂对n熔4在初级感觉神经元表达的影响：将PAR4激动剂AYPGKF．NH2(10uM)加入培养的DRG神经细胞内作用1小时，W色stemblot结果显示：PAR4激动剂使PAR4蛋白的表达量增加，加PAR4激动剂组与空白对照组比较有统计学意义∽

8、空白对照组相比PAR4mRNA的表达量增加1．2倍，加PAR4激动剂组与空白对照组比较有统计学意义(P