dj1低表达对心肌细胞缺氧预适应延迟保护影响的研究

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1、摘要目的：构建靶向DJ．1的RNAi真核表达载体，观察DJ．1低表达对心肌细胞缺氧预适应(APC)延迟保护的影响，以求反向阐明DJ．1是否作为内源性保护蛋白通过其抗氧化应激作用参与心肌细胞APC延迟保护。方法：1、设计靶向DJ．1基因的3条候选IⅢA干扰序列，利用真核表达载体pGPU6／GFP／Neo构建重组质粒，瞬时转染H9c2心肌样细胞后，I汀．PCR和WestemB10t检测DJ．1Ill】[矾A和蛋白表达，筛选最有效的RNA干扰靶片段用于后续细胞实验；2、H9c2心肌样细胞随机分为5组：①正常对照(Con仃01)组；②pGPU6／GFP／Neo

2、．shDJ．1+Con仃ol组；⑨缺氧／复氧(A瓜)组；④缺氧预适应(APc)组；廷卯GPu6／GFP／Neo．s11DJ．1+APc组。实验处理后，通过RT．PCR和WestemBlot检测DJ．1删[矾A及蛋白表达；MTT法检测细胞存活率：按试剂盒说明测定各组细胞内LDH的活性，比色法测定细胞内MDA含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH．Px的活性；流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量；分析DJ．1基因沉默前后APC对上述指标影响的变化。结果：1、经酶切及DNA测序鉴定证实成功构建了各重组I斟A干扰真核表达载体包括靶向DJ．1基因的3个候选

3、重组载体pGPU6／GFP／Neo．shDJ．1．A，B，C及阴性对照pGPU6／GFP／Neo．sh．NC。此外，RT．PCR和WestemBlot检测结果显示pGPU6／GFP／Neo．shDJ．1．B重组载体瞬时转染抑制靶基因表达的效果最强，H9c2细胞中DJ．1训刚A和蛋白表达的抑制率均在75％以上；2、H9c2细胞经AR处理后，细胞存活率明显下降、LDH活性增加：细胞内MDA及I的S含量显著增加，抗氧化物SOD、CAT、GSH．Px的酶活性下降，与Co曲『ol组比较均有显著性差异(p

4、伤。而H9c2细胞预先经APC处理后，显著提高了丸R损伤心肌细胞的生存率，并显著抑制LDH的活性；同时，APC减少～R心肌细胞内MDA、ROS含量，增加内源性抗氧化酶SOD、GSH．Px、Catalase活性，表明在H9c2细胞水平上APC能对抗A瓜所诱发的氧化应激，产生延迟保护。此外，结果发现：APC在对抗AR所诱发的氧化应激，产生延迟保护的同时，明显上调了DJ．1瑚RNA及蛋白表达，而RN～沉默DJ．1基因表达后，APC上述效应被摘要逆转。结论：1、成功构建了靶向DJ．1基因的I斟舢真核表达载体，为进一步研究DJ．1蛋白功能、探讨DJ．1在心肌I瓜

5、损伤保护中的作用及机制奠定基础；2、DJ．1作为内源性保护蛋白通过其抗氧化应激作用参与了心肌细胞缺氧预适应延迟保护。关键词：缺氧预适应，延迟保护，DJ．1，基因转染，RNA干扰注：本文受到国家自然科学基金(№：81060022)和江西省自然科学基金(№：2010GzY0220)资助。IIlABSTRACTobjecti、，e：T0cl撕母whemerDJ·1aSaIlendogenousprcItectiVeprotein叭olVedinmedelayedprotectionofa110xicp玎econditioIling(APC)inH9c2cel

6、ls，访acons仇lc缸gDJ-lgene-specificsmallne疵mgIⅢA(siI矾A)expressionVectorsaIldinveStigatinge妇FectsofDJ-1genesilenceont11edelayedc莉ioprotectionofAPCag咖StaIloxia／reoxygenationi巧ulyMethods：1．n睇ecalldidateRNAiIlterference(RNAi)sequencestaJ．getingDJ·1weredesi印eda11dinsenedintopGPU6／GFP／Neo

7、expressionVectortoconstnJcttllerecombinaIltpl枷ds．Subsequently，meserecoIIl_binaIltplasmidswere仃aIlsiently乜aIlsf．ectedintoH9c2cellsaCcordingtot11einStl眦tionsofthemanuf．acturer．neire伍caciesinextillguismngDJ一1expressionwereeValuatedbyImPCRaIldWestemBlot．TheRNAirecombinantplaSmidtest

8、ifiedbeingmoste虢ctiVewaSusedforsubsequentexperi