乳腺癌转移相关基因生物信息学的分析及功能的研究

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1、f燃剌哕博士学位论文乳腺癌转移相关基因的生物信息学分析及功能研究博士研究生：余海浪指导教师：马文丽教授摘要研究背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤性疾病，远处组织器官转移与乳腺癌患者的治疗和预后有着密切的关系，也是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。目前，乳腺癌的预后指标主要以临床分期、病理类型和淋巴结转移等为主，但这些指标难以对肿瘤细胞的转移潜能或转移状态进行准确评估。大约有10％．15％的乳腺癌患者在首次确诊后3年或更长时间都会伴有其它严重疾病或发生远处转移，因此，乳腺癌患者终身都会经历乳腺癌转移的风险。转移与复发已成为乳腺癌病人术后生存的主要

2、障碍，研究与乳腺癌细胞侵袭、转移相关的分子靶点对预防乳腺癌术后复发、提高疗效有重要意义。乳腺癌转移与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因子相互作用和相互影响的复杂过程，也是肿瘤防治工作中面临的难题，只有有效控制、阻断肿瘤转移才可能实现肿瘤的治愈。肿瘤在演进过程中，一些肿瘤细胞具有了侵袭和转移能力，而这种转移表型的获得在很大程度上是由于肿瘤细胞内基因发生异常改变引起的。因此，从分子水平揭示肿瘤转移的本质，研究肿瘤转移相关基因成为肿瘤转移研究的热点。近年发展起来的基因芯片技术显示了其在分析疾病方面的优越性。摘要基因芯片是21世纪生命科学领域的一项重要的技

3、术平台，是筛选差异表达相关基因的有效手段，具有高通量和快速测量等优点。由于表达谱芯片在研究细胞基因表达模式上具有的优势，利用它可获取肿瘤细胞生长的各期以及肿瘤发生与发展过程中相关基因的表达模式变化，因此，基因表达谱芯片已广泛应用于肿瘤发生机制、早期诊断、肿瘤基因分型、指导治疗及评估预后等研究领域。随着表达谱芯片技术的广泛开展，产生了丰富的、海量的、复杂的生物信息数据。如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息，揭示其中蕴含的生命特征和规律，己成为限制基因芯片技术应用和发展的主要“瓶颈"。生物信息学是综合利用生物学、计算机科学和信息技术来揭示大量而

4、复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘的一门交叉学科，它以生物芯片研究为基础，以序列比对、统计分析方法、可视化作图、生物聚类、通路分析及启动子预测等方法为手段，在分子水平进行数据挖掘、对疾病进行阐述，为肿瘤分子发病机理的研究开阔了新的研究思路，从而更加全面地从整体上对疾病进行研究。本研究以三组乳腺癌转移相关的基因表达谱数据(GSE2034，GSE2603，GSEl2276)为分析材料，采用GeneSpring软件筛选乳腺癌原发瘤和转移瘤芯片数据的差异表达基因，再结合生物信息学工具和文献挖掘等方法对差异基因及其相互作用关系进行分析，从中发现新的乳腺癌转

5、移相关基因COLlAl，最后再运用分子生物学实验对COLlAl基因进行功能研究，为乳腺癌转移的发病机制提供新的思路，也为转移性乳腺癌的分子诊断和个体化治疗奠定基础。研究方法1．以乳腺癌转移相关的三组组织标本芯片表达谱数据(GSE2034．172例淋巴结阴性、未复发的原发癌样本和98例淋巴结阴性但发展成远处转移的乳腺癌样本；GSE2603：47例原发乳腺癌样本，24例转移乳腺癌样本；GSEl2276-21例原发乳腺癌样本，160例转移乳腺癌样本)为研究材料，导入GeneSpringGXI1．5软件筛选乳腺癌原发瘤和转移瘤的差异表达基因，然后交叉比

6、较三组数据，得到共同上下调表达的乳腺癌转移差异基因。然后利用PANTHER、G舢ER、·Ⅱ博士学位论文GSEA、STRING和pSTllNG等方法对差异基因进行生物学分析和网络图谱构建，再通过iHOP文献挖掘工具鉴定出新的乳腺癌转移基因。2．根据人COLlAlmRNA基因编码区序列，设计并合成针对COLlAl的2条小发夹RNA(shRNA)模板脱氧寡核苷酸序列(siRNA．1及siRNA．2)和l条作为负对照的无关序列(siRNA．scramble)。利用pSilencer2．1．U6neo载体质粒构建了2种特异性COLlAlsiRNA质粒(p

7、shRNA．COLlAl．1和pshRNA．COLlAl．2)及1种无关序列质粒pshRNA．scramble，通过阳性克隆酶切鉴定及DNA测序鉴定来验证构建的重组质粒是否符合实验要求。3．在阳离子脂质体介导下，用重组质粒转染COLlAl过表达的人乳腺癌MDA．MB．231细胞株，筛选出阳性稳定转染重组质粒的细胞进行克隆，分别采用RT-PCR和Westernblot技术检测COLlAlmRNA和蛋白表达的变化，用MTT比色法和平板克隆形成试验检测细胞增殖活性，流式细胞仪测定细胞周期变化和细胞凋亡情况，平板粘附模型检测细胞的粘附能力，采用运动小室

8、实验检测细胞的运动侵袭能力。●研究结果1．乳腺癌转移相关基因的筛选及生物信息学分析利用GeneSpring生物分析软件共筛选出差异基因147个，其中表