cripto-1(cr-1)在鼻咽癌中作用及其机制的研究

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1、南方医科大学博士学位论文Cripto-1（CR-1）在鼻咽癌中的作用及其机制研究姓名：吴正蓉申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：姚开泰20090518博士学位论文Cripto．I(CR．1)在鼻咽癌中的作用及其机制研究博士研究生：吴正蓉指导教师：姚开泰教授摘要研究背景和目的鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的一种头颈部恶性肿瘤。目前普遍认为EB病毒、化学致癌物和遗传易感性是促使鼻咽癌发生发展的三大因素，但NPC的分子发病机制尚不完全清楚。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤，且其发生部位较为隐蔽，因此多数病人在确诊时都为中、晚期且常伴有转移，且治疗后五年生存率始终在60％以下

2、，因此继续探索鼻明癌发病的分子机制、寻找有价值的早期诊断生物标志物及治疗靶标仍具有重要意义。人Cripto一1(CR-1)，是表皮生长因子-CFC(epidermalgrowthfactor-Cripto．1／FRLl／cryptic，EGF．CFC)家族成员，是一个由188个氨基酸组成的细胞外糖蛋白，为早期胚胎发生所必须。Cripto．1在体内有两种活性形式：一是通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)键锚定于细胞膜上作为复合受体；二是GPI键断裂后以可溶性分泌蛋白的形式作为生长因子样的配体。虽然Cripto．1是胚胎干细胞的一个标志，成体内通常

3、不表达，但却过表达于75％．80％的乳腺癌、结肠癌、肺癌以及50％．60％的胃癌、胰腺癌、卵巢癌及睾丸癌。此外，Cripto．1的表达在诸如结肠腺瘤、胃的肠上皮化生及乳腺导管原位癌等癌前病变中亦显著提高。Caterina等2006年报道血浆Cripto．1水平可作为是早期发现结肠癌和乳腺癌的生物标志物。体外实验和转基因鼠研究均表明，Cripto．1通过促进细胞增殖、生存、迁移、侵袭和诱导细胞转化、上皮．间充质转化中文摘要(epithelial．to．mesenchymaltransition，EMT)及肿瘤血管形成等在肿瘤发生发展中发挥瘤基因的重要作用。由于Cripto．1在肿瘤组织高表达，正

4、常组织低表达甚至不表达，因此它也是恶性肿瘤治疗的新靶点。体内体外实验均证明，拮抗Cripto．1的反义寡核苷酸及中和性封闭Cripto．1的单克隆抗体能明显抑制结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌及白血病细胞的生长。尽管目前已证IjfJCripto．1与某些恶性肿瘤发生发展存在相关，而且也展现出作为新的早期诊断和分子生物治疗靶点的潜力。然而，Cripto．1与鼻咽癌的关系如何，迄今尚无相关报道。同时，Cripto．1为何在肿瘤中重新高表达，其始动因素尚不得而知。因此本课题旨在研究Cripto．1在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性；进一步通过改变Cripto．1的表达水平观察其对于鼻咽癌细胞生物学特性的影

5、响；最后利用荧光差异双向凝胶电泳的蛋白组学方法，初步探讨Cripto．1在鼻咽癌发病机制中所涉及的信号通路，从而为进一步理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。研究内容与方法1．鼻咽癌@Cripto一1表达特性的鉴定及临床意义采用免疫组化、Westernblot、荧光定量RT-PCR及RT-PCR方法从蛋白和mRNA水平检钡tJCripto-1在临床鼻咽癌组织标本及鼻咽癌细胞系CNEl、CNE2、SUNEl、HNEl、HONEl和C666．1中的表达情况，并分析其与临床特征的联系，探讨Cripto-1与鼻咽癌发生发展及侵袭转移的关系。2．Cripto-1表达沉默

6、对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响利用已知的Cripto-l干扰片段，构建含H1启动子和绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的慢病毒载体，将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒，收集病毒上清，进行病毒滴度测定。将含Cfipto-1特异干扰片段的慢病毒感染CNE2细胞，以空载体的病毒为阴性II博士学位论文对照，利用GFP的表达用流式细胞仪筛选出稳定的干扰株。荧光定量PCR法检测Cfipto．1在干扰前后mRNA的变化；Westernblot法检测干扰前后Cripto一1蛋白表达的情况；用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检沏fJCfipt

7、o．1沉默后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响；利用体外侵袭实验(Boydendx室)检钡lJCripto．1沉默后对鼻咽癌细胞体外侵袭能力的影响。3．Cripto．1过表达对鼻咽癌细胞CNEl生物学特性的影响应用PCR、酶切及DNA测序鉴定Cripto．1真核表达载体pCI／CR．1。用其转染鼻咽癌细胞CNEl，以空载体pCI／neo为阴性对照，应用G418进行筛选获取Cripto．1稳定过表达的细