慢性肾脏病的尿液蛋白质组学及升清降浊胶囊的作用机制研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全

2、部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)Et期：切，妒年5月摘要目的：慢性肾脏疾病(chronickidenydisease，CKD)是一个全球性的医学问题，近年来CKD的发病率明显升高，严重威胁着人类的健康与生命。早期发现、早期诊断能够提高该病的治疗效果，从而减轻个人和社会的负担。因此，积极寻找CKD的早期标志物，有助于阐明CKD发病机制，提高诊断和疗效，也有助于寻找新药的作用靶点。CKD的病因包括肾小球疾病、肾小管问质疾病、肾血

3、管疾病、代谢性疾病和结缔组织疾病性肾损害、感染性肾损害及先天性和遗传性肾脏疾病等。在我国，CKD患病率约为9％--一14％，病因以原发性慢性肾小球肾炎最为多见。CKI)进展至中后期(CKD3—5期)，肾功能中重度受损，肾脏排泄、分泌及调节等功能逐渐丧失，导致水电解质紊乱，酸碱平衡失调，氮质代谢产物和毒素潴留等症状。CKD3—5期属于中医学“虚劳”、“水肿”、“癃闭”、“关格”等范畴。升清降浊胶囊是我科名老中医洪钦国教授针对CKD3—5期中医基本病机——脾肾亏虚，浊毒瘀阻而创立的有效制剂。本研究以原发病为原发性肾小

4、球肾炎的CKD3-5期(非透析)患者为研究对象，观察升清降浊胶囊对CKD3—5期患者的肾功能、钙磷代谢、营养状态、血脂水平及中医症候的改善情况，探讨升清降浊胶囊的疗效机制。尿液检查由于其样本收集的无创性在临床疾病的诊断中扮演了重要的角色。尿液蛋白质组学已经被广泛用于探究肾脏疾病的发病过程。本研究利用尿液蛋白质组学技术寻找CKD早期诊断及监测疾病进展的蛋白标志物，进一步探明CKD的发病和进展机制。同时，通过分析升清降浊胶囊治疗CKD3期、CKD4—5期前后的差异蛋白，筛选升清降浊胶囊的药物靶点蛋白，探讨其作用机制。

5、方法：1．临床研究共纳入79例CKD3-5期(非透析)患者，其中CKD3期40例，CKD4期19例，CKD5期20例。三组患者在给予低蛋白饮食、控制血压、纠正水电和酸碱平衡等基本治疗的基础上加服升清降浊胶囊，治疗12周后，分析三组患者治疗前后的中医症状、中医证候积分及实验室指标(血肌酐、血尿素氮、肾小球滤过率、白蛋白、胆固醇、甘油三酯、血红蛋白、血钙、血磷、钙磷乘积和尿酸)的情况。2．实验研究共纳入CKDl—5期(非透析)患者40例，其中CKDl期、CKD2期、CKD3期、CKD4—5期各10例(CKD3期和CK

6、D4—5期从临床试验患者中随机抽取，接受过升清降浊胶囊12周的治疗)，收集同期来自体检中心的健康志愿者10例。采集各组及CKD3期、CKD4—5期升清降浊胶囊治疗后的新鲜中段尿，将每组10例尿液进行组内混合。利用iTRAQ标记联合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS／MS)技术进行定量的尿液蛋白质组学研究，具体步骤包括：蛋白质提取、去除高丰度蛋白、蛋白质纯化、蛋白质浓度测定、SDS—PAGE、蛋白质酶解、iTRAQ标记、二维液相色谱与串联质谱。最后，以质谱文件为原始文件，利用Mascot软件在IPI(Intern

7、ationalProteinIndex)的数据库中进行肽段信息搜索，根据iTRAQ标记定量的蛋白质相对丰度来寻找差异蛋白质，并进行蛋白质功能分析。结果：1、临床研究：(1)一般资料分析：CKD3期组患者中男23例，女17例，年龄分布29—65岁，平均年龄为(43．93士9．20)岁；CKD4期组患者中男10例，女9例，年龄分布24岁一68岁，平均年龄为(48．95士14．68)岁；CKD5期组患者中男7例，女13例，年龄分布28—70岁，平均年龄为(55．95士13．40)岁。三组患者平均年龄有明显差异(P<0．

8、01)，随着CKD病情的进展，患者的平均年龄逐渐增高，其中CKD5期组患者平均年龄明显高于CKD3期组(P0．05)。·(2)中医证候疗效：三组治疗后主要中医临床症状较治疗前均有明显改善；中医证候积分较治疗前均有明显降低，差异有统计学意义(P<0．01)；中医证候疗效显著，其中CKD3组中医症候疗效：显效10例，有效30