微透析技术应用于吉非替尼(gefitinib)药动学研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期：2014年04月07日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被

2、查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者论文导师签2014焦摘要『UllUlIIIIIIIIIIIIIJY2623434课题来源：广东省科技计划项目《多西紫杉醇和卡铂化疗序贯CJefitinib--线治疗晚期NSCLC的系列研究》(基金项目编号：20098030801035)。目的：通过系统的研究，建立Gefitinib微透析采样方法，并采用内标微透析．血药浓度

3、联用技术进行Gefitinib的药动学研究，为抗肿瘤药物的靶向性研究提供新的思路，亦为微透析技术应用于油水难溶性及高蛋白结合型药物的药动学及药效学研究提供新的途径。方法：1建立GefitinibHPLC分析方法采用HPLC—UV，外标法测定Gefitinib和Erlotinib生理盐水(pH3．22)及甲醇溶液浓度，并考察色谱条件的专属性、标准曲线、精密度、准确度、定量限、检测限、稳定性等。采用HPLC—UV，以Erlotirtib为内标物，测定含药血浆中Gefitinib浓度，考察色谱条件的专属性、标

4、准曲线、精密度、准确度、基质效应、稀释试验、稳定性以及血浆样品处理回收率等。2建立Gefitinib反向微透析采样方法采用浓差法(增量法、减量法)测定Gefitinib体外回收率(欺g)及释放率(如g)，探讨灌流液流速、灌流液pH、探针外液浓度、环境温度对如．g的影响及体内外‰与Ro．g的稳定性，分析讨论反向微透析技术应用于Gefitinib药动学采样的可行性。3采用反向微透析技术测定Gefitinib离体血浆蛋白结合率将微透析探针置于梯度浓度含药血浆中，以生理盐水溶液(pH3．22，含5％--甲基亚砜

5、)为灌流液进行灌流，待探针透析及药物与蛋白结合达到平衡状态后，收集透析液测定浓度。同法，以空白血浆为探针外液，灌流含药生理盐水溶液(pH3．22，含5％二甲基亚砜)，测定探针如g。以而g等价于‰g，推算Gefitinib在梯度浓度离体血浆中的蛋白结合率。4建立Gefitinib内标微透析采样方法以Erlotinib为内标物，采用浓差法(增量法、减量法)测定Gefitinib与Erlotinib体外回收率(或释放率)比值尸，并探讨灌流液流速、探针外液浓度、环境温度对P值的影响及在体比值尸’的稳定性，分析讨

6、论内标微透析技术应用于Gefitinib在体药动学研究的可行性。5传统血药浓度法测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefitinib的药动学参数大鼠灌胃或尾静脉注射给予Gefitinib药液后，自眼球后静脉丛采血，以ErlotinibT为内标物，HPLC法测定血药浓度。采用WinNonlin4．0．1软件对大鼠两种给药方式Gefitinib的血药浓度(C)与时间(f)数据进行拟合，推算主要药动学参数。6内标微透析．血药浓度联用技术采样测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefainib的药动学参数以脂肪乳注射液(20％，

7、含ErlotinibO．508lag．mLl)为灌流液，采用内标微透析技术采集大鼠灌胃或尾静脉注射给予Gefitinib后心脏，脑部纹状体及皮下三个采样位点的游离药物，并通过HPLC测定透析液浓度。以Erlotinib释放率(RD。)实时校正Gefitinib的砾．。，联合血药浓度法测定值，二次校正体内药物浓度。采用WinNonlin4．0．1软件对大鼠两种给药方式Gefitinib的血药浓度(C)与时间(f)数据进行拟合。7建立人肺腺癌细胞(A549)培养方法以人肺腺癌细胞(A549)为培养对象，优化

8、确立细胞复苏，传代，冻存，移植方案，奠定局部肿瘤动物模型基础。结果：1外标法测定Gefitinib生理盐水(pH3．22)及甲醇溶液浓度的色谱条件色谱柱(DIKMA，PlatisilODS，5u毗150x4．6mm)；保护柱(通用型SecurityGuardTM)：流动相：甲醇．水【吉三乙胺020／4(80：20)：流速：1．0mL．min一：检测波长：330nm；柱温：25℃；进样量：10pL。2外标法测定Gefitinib、Erloti