era及其相互作用因子功能的研究

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1、第四军医大学博士学位论文独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文

2、或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期：第四军医大学博士学位论文Era及其相互作用因子功能研究博士研究生：黄勇导师：陈苏民教授辅导教师：陈南春高级实验师第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安710032中文摘要Era同源分子在生物界分布广泛，从原核生物细菌到真核生物、小鼠、人，Era形成一新的G蛋白亚家族，在生物体内发挥着重要的作用。在原核生物中，Era参与细胞周期调控和核糖

3、体rRNA的加工与成熟，是细菌生长必需的GTPase分子，era基因突变引起的Era分子的GTPase活性缺失或合成减少将导致细胞分裂期阻滞和核糖体rRNA成熟障碍；在哺乳动物，Era在多种正常组织中表达，Era突变或Era的表达减少可引起细胞周期阻滞。但目前Era确切的功能机制仍然不清。因此，进一步研究Era的功能对于我们系统地认识生物的生存机理和Era这一新的G蛋白亚家族在细胞中的生理作用都具有重要的理论意义。为了进一步研究Era的功能，本课题组陈南春高级实验师用地高辛(DIG)标记的Era蛋白从大肠杆菌基因组噬菌体表达文库中筛选了Era相互作用分子。本研究在此基础上，我们对筛选到的

4、YggG分子与Era蛋白间的物理和功能相互作用、yggG基因的表达特征、表达调控、以及YggG在大肠杆菌中的作用进行了深入的研究。同时在哺乳动物水平，检测了人era在多种肿瘤组织中的表达特征，以及在腺上皮和鳞状上皮的表达特征，并分析了人Era的表达与腺癌鳞癌的关系，从中我们探讨了Era分子在细胞内-2-第四军医大学博士学位论文可能的功能机制。主要研究结果包括：1.YggG是一Era结合蛋白。在利用地高辛标记的Era从大肠杆菌基因组表达文库中筛选Era结合分子实验中，我们发现yggG基因表达产物与Era存在相互作用。在此研究中通过GSTpull-down和免疫共沉淀实验进一步在体外和体内证

5、实了Era与YggG蛋白间的相互作用。并且在实验中我们发现Era-1突变体蛋白同样与YggG蛋白间存在结合作用，此结果提示Era蛋白的GTPase酶活性不影响Era与YggG蛋白间的物理性相互作用。2.yggG基因的表达特征及表达调控。yggG基因编码一25kDa预测的锌离子结合的金属蛋白酶，氨基酸序列分析显示YggG与其它一些热休克蛋白有较高的同源性。但至今未见关于yggG基因的任何研究报道。在本研究中，我们利用5'-RACE(5'-rapidamplify-cationofcDNAends)确定了yggGmRNA的5'-末端，即转录起始位点(+1)，序列分析发现，yggG转录起始位点

6、上游的DNA序列与大肠杆菌保守的启动子序列存在同源性，即-35(TTCACCversusTTCAGA)，-10(TAGAATversusTATAAT)，一个可能的核糖体结合序列(AAGAG)位于目前GenBank所预测的YggG蛋白翻译起始位点前。为了分析转录调控，我们首先构建了原核分子报道载体系统，并对该系统进行了鉴定，将所预测的yggG启动子区域不同的截短片段与lacZ报告基因融合，不同截短体报道基因载体转化菌分别在应激条件和非应激条件下培养，通过β-半乳糖苷酶的活性检测确定截短片段的启动子活性和转录活性。结果显示，包含有yggG基因转录起始位点前39bp的DNA片段具有启动子活性，

7、而转录起始位点上游-339/-40的DNA片段不具有启动子-3-第四军医大学博士学位论文活性。此结果说明，yggG基因的启动子区位于-39/-1。进一步的研究发现，在热应激条件下，包含有yggG基因转录起始位点前-105/-1的DNA片段的转录活性明显增加，而包含有yggG基因转录起始位点前-39/-1的DNA片段的转录活性没有明显变化。此结果提示，yggG基因转录起始位点前的-105/-40与应激诱导的转录调控相关。为了证实DNA