巢湖鸭mstn基因多态性及其与体重和屠宰性能的关联性研究

《巢湖鸭mstn基因多态性及其与体重和屠宰性能的关联性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

万方数据AnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationStudiesofMSTNGenePolymorphismandItsRelationshipwithBodyWeightandCarcassTraitsinChaohuduckPostgraduate：YanXiangSupervisor：Prof．GengZhao—yuCo—supervisor：AssociateProf．ChenXing-yongSpecialty：AnimalGenetics，BreedingandReproductionResearchField：AnimalMolecularGeneticsCollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversity,Hefei，230036Herei，Anhui，P．R．ChinaMay,2014 万方数据IIlllIIlllllIIllIllIY2753871本论文受以下项目资助国家水禽产业技术体系(CARS一43．31)安徽畜禽产业共性技术研究院Thispaperissupportedby：orteoby一一一一NationalWaterfowlIndustryandTechnologySystem(CARS一43．31)AnhuiInstituteofGenericIndustrialScienceandTechnologyinLivestockandPoultry 万方数据独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：夔扣签字日期：沙，千年占月了日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据库》，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)。学位论文作者签名：趋翔签字日期：z洲午年r月歹日指导教师签名：签字日期：≯c学位论文作者毕业后去向：么丛垒工作单位：盔缱巳巫盘电话：Z￡Z坦!星!￡三』二通信地址：，锰疵刍豳厦塑蛭经盥呈缱邮编：22芝!星z 万方数据摘要肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是转化生长因子13(TGF．D)超家族的一员，作为肌肉生长的负调控因子，通过抑制成肌细胞的增殖而发挥作用。巢湖鸭属优质中型肉蛋兼用型鸭种，肉质优良，但早期生长速度较慢。本试验测定了巢湖鸭生长不同阶段体重和上市前屠宰性能，探讨巢湖鸭的生长发育规律；采用PCR．SSCP方法检测MSTN基因的5’调控区、内含子2和三个外显子片段的SNPs，分析MSTN基因在群体中遗传多样性及其与肌肉生长发育的关联性。巢湖鸭公鸭初生重、4周龄、8周龄和12周龄体重的“平均值±标准差”分别为46．6-t-3．49、551．58+85．669、1228．244-159．139、1740．74-4-204．889，母鸭依次分别为46．84-4．419、468．67___65．599、1219．03±154．829、1476．75±149．449；公鸭屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率(％)分别为88．30±5．05、80．41-4-6．13、73．12±6．08、10．55±1．44、13．60±1．36，母鸭依次分别为91．25±2．74、83．66±4．16、76．95±4．23、“．13±1．49、13．48±1．50。公鸭在4周龄、12周龄体重上均极显著高于母鸭(P<0．01)，而屠宰性能显著或极显著低于母鸭(p<0．05或p<0．01)，说明巢湖鸭公鸭生长速度快于母鸭，而母鸭屠宰性能相对较高。MSTN基因内含子2和外显子3分别检测到一处点突变，G6375A和T5264C，分别为AA、AB、BB和DD、DE、EE各三种基因型。矛检验结果表明群体在6375位点处于Hardy．Weinberg不平衡状态；公鸭群体在5264位点各基因型分布处于Hardy．Weinberg平衡状态。基因型与性状的关联分析表明，公鸭AA型半净膛率和胸肌率显著高于BB型(P<0．05)；母鸭AB型胸肌率显著高于AA型和BB型(P0．05)。母鸭EE型屠宰率、半净膛率和全净膛率均显著高于DD型(P<0．05)，公鸭各基因型间在体重和屠宰性能上差异均不显著(P>O．05)。母鸭ABDD型胸肌率显著高于AADD型(P0．05)．Twopointmutationshavesignificanteffectsonproductiontraits．VarianceanalysisshowedthatAAgenotypehadsignificanthigherbreastmuscleratethanBBgenotypeinmalecolonies(P0．05)．CombinedgenotypesinfemalecoloniesshowedthatABDDgenotypehadsignificanthigherbreastmuscleratethanBBDDorAAEEgenotype(P<0．01)andAADDgenotypefP<0．05)，andsignificanthigherlegmuscleratethanBBDDgenotype(P<0．05)；Comprehensivetheaboveresults，ABDDgenotypeoffemailshowedhigherslaughterperformance．ThisstudyfirstanalyzesthepolymorphismfragmentsofMSTNgeneinchaohuduck．andthecorrelationbetweenthepolymorphismlociandproductiontraits，makeformeresearchofMSTNgeneinpoultrytoanother,promotedtheMSTNgeneawiderr觚geofapplications．Keywords：Chaohuduck，MSTNgene，PCR．SSCP，Bodyweight，CarcasstraitsIII 万方数据目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一II目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IV缩略词(Abbreviation)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯VI1．文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1巢湖鸭⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2单核苷酸多态性(SNP)标记研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．3肌肉抑制素基因(Myostatin，MSTN)的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．u．1MSTN基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．3．2MSTN基因的功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．3．3MSTN在畜禽育种上的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯Ⅵ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．1材料、仪器和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．1．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．62．1．2主要仪器及设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．1．3主要药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．4常规溶液及试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．5软件工具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2．1体重和屠宰性能测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．2．2血样采集和基因组DNA的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．2．3引物设计和最佳PCR反应条件的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．2．4PCR扩增及单链构象多态性检测(SSCP)⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．2．5PCR产物纯化和克隆测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．2．6数据统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯123．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．1巢湖鸭体重和屠宰性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．2MSTN基因多态分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．2．1基因组DNA的提取与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．133．2．2PCR扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13IV 万方数据3．2．3SSCP检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯153．2．4MSTN基因型频率和基因频率分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．2．5测序分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．3基因型与体重及屠宰性能关联分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯184．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．214．1巢湖鸭体重和屠宰性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2l4．2巢湖鸭MSTN基因多态性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯214．3MSTN基因多态与生产性能的关联性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21结{仓⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26作者简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27 万方数据缩略词(Abbreviation)VI 万方数据1．文献综述我国地域广大，是鸭资源最丰富的国家，不同地域生态和地理环境差异巨大，逐渐形成了具有各自地域特点的鸭品种。根据联合国粮农组织(FAO)统计结果，鸭业养殖主要分布在中国和东南亚各国，且以我国饲养规模最大，鸭存栏量占全球总存栏量一半以上。近年来畜禽消费量不断增长，消费者对鸭的需求也在持续增加。随着人们生活水平的提高和生活方式的转变，人们越来越倾向于食用绿色无污染、健康无公害和营养价值高的食品，这也对我国养殖业提出了更高的要求。1．1巢湖鸭巢湖鸭属优质中型肉蛋兼用型鸭种，是安徽省当家鸭种。巢湖鸭肉嫩味美、体肤骨细皮薄，并且脂肪适当，体型匀称紧凑，羽毛以黑灰为主，富有光泽，趾蹼橘黄色，爪泛黑色。巢湖鸭生长较快，幼鸭饲养百日以后，即可达两千多克重，母鸭长大后每年能产蛋170个左右。目前巢湖鸭的饲养数量越来越多，正不断地销往各地市场。2009年7月，安徽省农业委员会公布了一批安徽省省级畜禽遗传资源保护名录，巢湖鸭被列入其中。因此，探讨如何在不失去巢湖鸭原有优点的基础上提高它的生产性能，改善饲料报酬，加快饲养周期以及作为父母代改良肉用品种鸭，有助于对巢湖鸭进行人工选育。1．2单核苷酸多态性(SNP)标记研究现状单核苷酸多态性(SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的sNPs【1】o实际上，SNP位点在染色体上的分布并不均匀【2】，分布在非转录区的概率远远大于转录区，即SNP位点分布在基因外显子内的概率低而分布在基因内含子的概率高。在畜禽遗传育种中利用SNP标记等位基因的特点，在短时间内可检测大量的样品，如对猪氟烷基因、雌激素受体基因的多态性进行快捷的检测【3]。Clop等【4】在特克西尔绵羊MSTN基因的3’UTR发现一个G／A转换的SNP，导致该基因在翻译水平上受到抑制而使绵羊肌肉肥厚。姜运良等【5】应用PCR-RFLP和PCR．SSCP的方法对几个猪品种的MSTN基因3个不同位点的SNP进行分析，发现3’编码区的SNP发生频率较低，内含子1和5’调控区SNP所产生的等位基因表现为连锁遗传。SNPs的检测方法中最便捷的就是单链构象多态性(SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP)，其原理是：经过PCR扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的产物。使用变性剂使双链DNA变性成单链DNA，单链DNA上的碱基 万方数据自由结合配对，形成较稳定的具有一定构象的空间结构，如果单链DNA中的某一位置发生了碱基突变、缺失或者插入，其构象就会发生变化，在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，就会表现出不同的电泳速度。耿照玉等【6】用PCR-SSCP方法分析了皖西白鹅PRL(催乳素)基因外显子2的多态性并发现了1个SNP位点，矛分析表明基因型在群体内分布存在极显著差异伊<0．01)。魏茹华等【7】运用PCR-SSCP方法对皖西白鹅GnRH(促性腺激素释放激素)基因57端调控区进行多态性检测也发现了3个SNP位点，分别为GnRH基因57端调控区的．192位置存在G／C转换、．206位置存在朋转换和．417位置存在T／G转换的多态性位点。杜晓东等【8】以皖西白鹅和朗德鹅为素材，运用PCR．SSCP方法检测IGF．I基因57调控区的单核苷酸多态性并发现该区域存在4个SNP位点。朱盼等【9】运用PCR-SSCP法检测了皖西白鹅和莱茵鹅PRLR基因外显子10的单核苷酸多态性，结果在皖西白鹅群体中发现多态性而在莱茵鹅群体中则不存在多态性。涂小璐等【10】通过PCR-SSCP检测发现，文昌鸡FSHB(促卵泡激素B)基因57端呈现多态性，共检测到了3种单倍型基因型，测序发现该片段有6个SNP位点，说明文昌鸡FSHp基因57端存在丰富的碱基突变，FSHB基因可作为文昌鸡早期产蛋量分子标记。SNP作为遗传标记有以下几个优点：(1)分布广泛，数量多且具有遗传稳定性，作为鉴定分子标记比较适合。(2)检测结果为共显性，易于分型。(3)适于快速、规模化筛查。1．3肌肉抑制素基因(Myostatin，MSTN)的研究进展肉用性能是畜禽最重要的经济性状之一，关系着养殖业的经济效益。长期以来，人们通过各种育种方法培育出来许多优良畜禽品种，为畜牧业的发展和人民生活水平的提高作出重大贡献。传统育种方法的应用已经成熟，目前分子育种正在快速发展，即在品种基因的基础上来选育优质畜禽群体。研究对畜禽生产性能有一定影响的基因，将是对分子育种工作的极大贡献。其中，肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)是影响畜禽生产性能的主要功能基因之一。MSTN基因是美国J110nHopkins大学的Mcpherron等【11】于1997年研究转化生长因子．p(transforminggrowthfactor，TGF．p)超家族时，发现的一种新的生长因子，又名生长／分化因子．8(growth／differentiationFactor，GDF．8)，蛋白质的同源性比较证明了MSTN是TGF．B超家族的一员。Mcpherron等【12】分析得出，该基因cDNA中只有一个可读框(ORF)，可编码376个氨基酸，其结构具有TGF．B超家族的典型特征。1．3．1MSTN基因MSTN基因在各类动物品种中广泛存在和表达，并且基因的氨基酸编码序列在进化过程中高度保守，在研究过的几乎所有哺乳动物和禽类中，其翻译的氨基酸活性部位的序列几乎完全一致。Gonzalez等【13】证实人的MSTN基因含有3个外显子和2个2 万方数据内含子，转录的mRNA大小为3．1kb，编码由375个氨基酸构成的前体蛋白。鸭MSTN基因全长约6．4kb，有3个外显子(NW004676457．1：长度分别为373bp、374bp、381bp)和2个内含子(NW004676457．1：长度分别为2016bp、2235bp)组成。1．3．2MSTN基因的功能当前的研究结果表明，不同种属MSTN基因序列都高度保守，MSTN的功能在不同种属间亦高度保守，其主要作用是抑制成肌细胞的增殖，是肌肉生长发育的负调控因子[14-15】。到目前为止，对MSTN的研究主要集中在其对骨骼肌生长发育的作用上，主要包括两方面：一是利用MSTN的调节功能治疗与骨骼肌萎缩相关的疾病，二是提高动物的生长性能。Mcpherron等【11】应用基因打靶技术使小鼠MSTN基因C．末端生物活性区缺失，得到突变纯合体小鼠，该突变体小鼠体重高出杂合小鼠和野生小鼠30％，并发现肩部和臀部的肌肉量明显多于正常小鼠，其骨骼肌纤维数高于野生小鼠86％，表明肌肉质量的增加是由于肌细胞增生和肥大造成的。这说明MSTN不仅对肌纤维肥大有影响而且对肌纤维数量也有极大影响，MSTN在调控骨骼肌生长发育上起着负调控作用。MSTN的功能可以被其前肽、follistatin(卵泡抑素)、FLRG(卵泡抑素相关基因)以及能阻断MSTN信号转导的其它物质如拮抗剂所抑制，其效果与MSTN敲除的老鼠表现一样[16-17]。Thomas等[18】证实了MSTN抑制肌肉生长是通过控制成肌细胞的数量、大小及生长的速度来实现的。MSTN基因主要影响骨骼肌的生长发育，对牛[191、猪[20-21]、鸡【22-25】的诸多研究表明，MSTN基因的突变或缺失影响肌肉的生长发育，MSTN是肌肉生长的负调控因子，该基因是与肌肉生长发育及肉用性状相关的候选基因之一。1．3．3MSTN在畜禽育种上的应用自从MSTN在肌肉生长发育中的调节作用被发现以来，既受到各国学者和专家的高度重视。MSTN的活性降低或丧失，能使肌肉组织的比例增加，因此在畜牧生产上有非常乐观的应用前景。因此，分离鉴定影响MSTN活性的突变等位基因并以此作为分子标记辅助选择育种已成为MSTN基因研究的热点之一。顾志良等【26】在研究鸡MSTN基因单核苷酸多态性与骨骼肌的关系时发现，不同基因型个体在初生重、屠体重、胸肌重、腿肌重上都有显著差异，并得出蛋鸡和肉鸡骨骼肌生长速度差异较大的原因是两者MSTN基因mRNA量的差异造成的。卢俊清等【27】对6周龄北京鸭MSTN基因57调控区的多态性研究发现Z2系和Z4系北京鸭AA型腹脂重(P<0．05)和胸肌重(P<0．10)都显著高于AB型。岳志刚【28】对绿头野鸭MSTN基因57调控区、外显子3和内含子2进行的SNP检测发现外显子3的两处SNP位点对绿头野鸭的出栏重、半净膛重、全净膛重、腿肌重和腿肌率有显著影响，而57调控区和内含子23 万方数据的SNP位点未对所测生产性状产生显著影响；易恒杰等【29】采用PCR产物直接测序的方法对三穗鸭MSTN基因外显子的SNP检测也发现突变位点对三穗鸭屠体性状具有重要影响。MSTN基因与骨骼肌生长关系密切，可以对其加以利用来获取更高的养殖效益，可以从以下几方面进行：(1)利用基因同源重组技术获得MSTN基因失效动物。(2)利用SNPs标记与生产性能紧密关联的基因位点，结合传统育种技术培育出优良畜禽品种。(3)利用RNAi技术干扰MS'INmRNA的表达，缓解其对肌细胞的抑制作用。(4)通过MSTN的抗体或抑制剂，降低其生物活性，治疗与肌肉萎缩有关的疾病或着开发新型饲料添加剂等。4 万方数据引言我国的家禽养殖历史悠久，种类繁多。地方品种普遍存在抗逆性强、肉质优良等特点，但生长速度较慢。国内外研究者们采用现代育种理论和方法应用于地方畜禽品种生产性能改良，获得了快速的进展，如皖西白鹅高产蛋品系，肉蛋兼用型昆山麻鸭等。巢湖鸭属肉蛋兼用型中型鸭种，味道鲜美且脂肪适中，符合人们日常饮食需求，但其早期生长速度较慢限制了其快速规模发展。为此，如何提高巢湖鸭早期生长性能成为研究重点。研究表明，MSTN基因作为肌肉生长的负调控因子，通过抑制成肌细胞的增殖调节肌肉生长，MSTN表达高低与禽类生长发育密切相关。本试验参照绿头野鸭MSTN基因(GenBank：NW004676457．1；GenBank：DQ419906．1)DNA序列设计引物，采用PCR-SSCP技术检测巢湖鸭MSTN基因外显子、内含子2和57调控区的单核苷酸多态性，并通过最d,Z-乘法分析所发现的单核苷酸多态性与巢湖鸭各时期体重和屠宰性能的相关性，进而分析MSTN基因多态性对巢湖鸭生长性能的影响。研究结果将有助于开发分子标记用于巢湖鸭生长性状的辅助选育。 2．材料与方法2．1材料、仪器和试剂2．1．1试验材料试验用巢湖鸭3000只，饲养于安徽太阳禽业有限公司，分布在同一鸭舍中分栏饲养，预混料饲养并自由采食(饲料配方见表1)。分别于初生、4周龄、8周龄、12周龄空腹称重。12周龄时随机抽取144只实验用鸭，公母各半，翅静脉采血，ACD抗凝并摇匀，编号后于．20℃保存。鸭屠宰后测定各屠宰性能。2．1．2主要仪器及设备(1)用于屠宰的剪刀，手术刀，托盘等(2)超净工作台：苏州净化设备有限公司(3)高速冷冻离心机：德国Eppendorf，5810R型(4)凝胶成像系统：江苏省捷达科技发展有限公司(5)高压灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司(6)PCR仪：美国Bio．RAD公司(7)DHG．9140型干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司zhikuquan20150721(8)DYY-6C型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂(9)电热恒温水浴槽，美国POLYSCIENCE公司(10)DYCZ．24A型电泳槽：北京六一仪器厂(11)培清JS．680D全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司(12)移液器：德国Eppendorf公司，2．5．1000ul(13)分光光度计：上海光谱仪器有限公司(14)SE．202F电子天平：奥豪斯仪器有限公司(15)．20℃冰箱，青岛海尔有限公司(17)格兰仕微波炉，顺德格兰仕电器厂万方数据 表1巢湖鸭饲料配方TablelFeedFormulaofChaohuDuck饲料类别编号原料名称原料价格(元／kg)原料配比(％)2280玉米f2级7．8％12．4449．001029大豆粕『2级44．2％I4．2023．400506DL．蛋氨酸32．OOO．150504石粉0．201．500505磷酸氢钙2．401．3005lO预混料4．501．000．5周龄0275碎米2．0011．50小鸭饲料004l米糠『2级12．165．000715酱糟2．103．000737硫酸钠0．900．250020赖氨酸[98．5％111．000．100557动物油6．800．700613胆碱6．00-．0．100008玉米蛋白粉156％14．303．00合计2．9025元倾100．00％zhikuquan201507211062L．赖氨酸硫酸盐8．300．500504石粉0．201．450505磷酸氢钙2．100．90051l食盐1．000．300510预混料5．101．006．12周龄0270小麦『3级12吲2．3641．00中鸭饲料1034玉米蛋白饲料[24％12．6520．OO106l元明粉0．600-300017胆碱150％15．400．100557猪油5．001．00004l米糠f2级12．1533，400506DL-蛋氨酸26．000．072280玉米『2级7．8吲2．340．00合计2．4079元／kgIOO．02％7万方数据 2．1．3主要药品与试剂(1)TEMED(N，N，N’，N’．四甲基乙二胺)：Promga公司(2)琼脂糖(Agarose)：西班牙YITOBio-instrumentCompany(3)10xTBE：上海生工生物工程(上海)有限公司(4)DNAMaker：天根生物科技有限公司(5)6xLoadingBuffer：北京全式金生物技术有限公司(6)PAGE：上海生工生物工程(上海)有限公司(7)GelRed：美国Biotium公司(8)TaqDNA聚合酶、引物、dNTP：上海生物工程技术有限公司(9)PremixTaq：TakaRa公司(10)DEPC：美国SIGMA公司(11)EasyPurCMBloodGenomicDNAKit：北京全式金生物技术有限公司(12)DNA纯化回收试剂盒：天根生物科技有限公司(13)EasyPureTMBloodGenomicDNAKit：北京全式金生物技术有限公司(13)I_tltraAmpPCRProducts：美国SorensonBioScience公司(14)SMA1000UVSpectrophotometer：美林恒通技术有限责任公司(15)pMDl9．TVector：TakaRa公司zhikuquan20150721(16)DH5a感受态细胞：TakaRa公司2．1．4常规溶液及试剂的配制(1)变性上样缓冲液：98ml去离子甲酰胺，O．5mol／LEDTA2ml，溴酚蓝O．0259，二甲苯菁0．0259。(2)10xTBE：Tris1089，NaEEDTA-2H207．449，硼酸559，去离子水定容至1L。(3)30％丙烯酰胺：109N一亚甲基双丙烯酰胺和2909丙烯酰胺融于体积为600ml的去离子水，加热到37℃，待溶解后定容至1000ml，过滤灭菌，置于棕色瓶中4"C保存。(4)10％AP：AP(过硫酸铵)lg，加去离子水至10ml，搅拌溶解于4"C保存数周。(5)LB液体培养基：109胰蛋白胨，59酵母提取物，109NaCl，溶于800ml水中，调节pH至7．0，定容至1000ml，高压灭菌。(6)75％乙醇(DEPC处理)：用DEPC水与无水乙醇配制成75％乙醇，4"C储存备用。(7)6×LoadingBuffer：2％溴酚蓝10mL，1％蔗糖50mL，混匀后，加去离子水定容到lOOmL，分装，4℃保存。(8)1．5％琼脂糖凝胶：lOOmL1xTBE缓冲液中加1．59琼脂糖，加热至完全溶解稍冷却后，加入适量染料使终浓度为0．5ug／mL。R万方数据 (9)ACD抗凝剂：柠檬酸0．489，柠檬酸钠1．329，葡萄糖1．479，加水定容至100ml，高压灭菌。使用时，按鲜血5：1ACD的比例添加。(10)PCR-SSCP缓冲液：去离子水甲酰胺99ml，5mol／LEDTAlml，二甲苯青0．1259，溴酚蓝O．1259，4"C储存备用。(11)0．2％硝酸银：取29溶于1000ml蒸馏水中，避光保存备用。(12)显色液：称量159NaOH溶于500ml水，加lml甲醛，现配现用。(13)10％聚丙烯酰胺凝胶：每70ml胶液含30％PAGE23ml，10×TBE7ml，APS330ul，TEMED50ul，ddH2040ml。(14)LB固体培养基：109胰蛋白胨，59酵母提取物，lOgNaCl，溶于800ml水中，加琼脂糖粉159，调节pH至7．0，定容至1000ml，高压灭菌。(15)Amp溶液：称取0．19Amp(氨苄青霉素)溶于2ml去离子水中配制成50mg／ml浓度溶海避光．20。C储存备用。2。1．5软件工具(1)序列查找网站：http：／／www．ncbi．nim．nih．gov／；(2)引物设计软件：PrimerPrimieri5；(3)序列分析软件：DNAStar，DNAMam(4)统计分析软件：SPSSl9．0。zhikuquan201507212．2试验方法2．2．1体重和屠宰性能测定方法(1)体重：分别于初生、4周龄、8周龄、12周龄时称量空腹体重。(2)屠体重：放血，去毛、脚角质层、趾壳和喙壳后的重量。(3)屠宰率：屠宰率=屠体重／宰前体重×100％(4)半净膛重：屠体去除气管、食道、嗉囊、肠、脾、胆、生殖器官、肌胃内容物及角质膜后的重量。(5)半净膛率：半净膛率=半净膛重／宰前体重×100％。(6)全净膛重：半净膛重减去心、肝、腺胃、肌胃、肺和腹脂后的重量。(7)全净膛率：全净膛率=全净膛重／宰前体重×100％。(8)腿肌重：去腿骨、皮肤、皮下脂肪后的全部腿肌。(9)腿肌率：腿肌率=两侧腿净肌肉重／全净膛重×100％。(10)胸肌重：沿着胸骨脊切开皮肤并向背部剥离，用刀切离附着于胸骨脊侧面的肌肉和肩胛部肌腱，将整块去皮的胸肌剥离，称重。(11)胸肌率：胸肌率=两侧胸肌重／全净膛重×100％。9万方数据 2．2．2血样采集和基因组DNA的制备每只鸭翅静脉采血3ml，置于盛有0．5mlACD抗凝剂的收集管中，编号混匀后．20℃保存。基因组DNA的提取采用北京全式金生物技术有限公司的DNA提取试剂盒(EasyPureTMBloodGenomicDNAKit)完成，操作步骤完全按照试剂盒操作方法进行，琼脂糖凝胶电泳检测提取效果并于．20"C保存。DNA提取步骤如下：(1)吸取抗凝血液20ul，加入RCL至总体积200ul，进行下一步操作。(2)加入20ulProteinaseK溶液，混匀。(3)加入220ulBB3，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间混匀数次，溶液应变为清亮。(4)加入220ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃掉流出液。(6)加入500ulCB3，12000rpm离心30秒，弃掉流出液。(7)加入500ulWB3，12000rpm离心30秒，弃掉流出液。(8)重复步骤7一次。(9)将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心2分钟，彻底去除吸附柱中残留的WB3。zhikuquan20150721(10)将吸附柱置于一个干净的离心管内，在柱的中央加入150ul去离子水，室温静置1分钟，12000rpm离心2分钟，洗脱DNA。(11)为得到更多DNA，重复步骤10，进行二次洗脱。洗脱后DNA于．20"C保存。2．2．3引物设计和最佳PCR反应条件的建立实验所用引物根据北京鸭MSTN基因的DNA序YU(GenBankNW004676457)，Primer5．0软件设计，其中针对内含子2所设计引物采用绿头野鸭序列(GenBankDQ419906．1)上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列、PCR产物大小及所在位置见表3。PCR最佳反应体系(表2)如下：表220I_tlPCR反应体系TabIe220I_tlPCRreacti011system配方组成用量ullO×buH酊2．5BIMgCl21。5BIdNTPMixture(1Ommol／L)1．01al上下游引物(IOBM／L)各1．0I．tlddH2011．8I．tl模板DNA1．0ulExTaq(IU／lal)0．2ul10万方数据 经过梯度PCR，筛选出各引物PCR扩增条件为：95。C预变性5min；95。C变性30s，52．60。C退火30s(退火温度因引物不同而异)，72=C延伸35s，共35个循环；72=C延伸10min；4。C保存。表3PCR扩增所用的引物序列、产物大小及位置TabIe3PrimersequencescorrespondingtoPCRproductsizesandpositionszhikuquan201507212．2．4PCR扩增及单链构象多态性检测(SSCP)按照各对引物所筛选的最佳PCR反应条件进行扩增反应，15％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，将扩增良好的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测目的片段是否具有单链构象多态性，记录具有多态性的各基因型个体和数量并拍照保存。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性的步骤如下：(1)用洗涤剂清洗玻璃板、垫条和梳子，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗一遍，烘干后用无水乙醇擦拭，晾干备用。(2)制板：两片玻璃板左右和下面用垫条垫好，将玻璃板放置于支架上，倾斜放置。(3)配制10％t}变性聚丙烯酰胺凝胶210mh30％丙烯酰胺69ml，10×TBE21ml，10％AP9909l，TEMED150山，超纯水120ml，用玻璃棒搅拌混匀。(4)灌胶：将玻璃板适度倾斜，从一侧缓缓注入胶液，不时轻敲玻璃板，使气泡上浮，直到注满，将模具倾斜放置在支架上。插入梳子，注意避免在梳子齿下面生成气泡，中途需补充胶液。约1．5h凝胶可聚合完全。万方数据 (5)聚合完全后，可以看见在梳子下方不远处有一条波纹状的折光线。此时，小心取下梳子并取出底部垫条，将玻璃板凹面朝内固定于垂直电泳槽中，立即用注射器冲洗胶孔，防止碎片堵塞。(6)电泳槽添加1×TBE缓冲液后，用带针头的注射器驱除凝胶底部和胶孔中的气泡，300V电泳预热半小时并祛除残余气泡。(7)加样：模板DNA与变性上样缓冲液1：1混合成lOgl，98。C变性10min后，立即冰浴7min，用10山移液枪上样。(8)加样完成后，240V电泳30min，然后低室温下160V电泳13h。(9)待电泳结束后，用刀或镊子从板底撬开玻璃(凹版向上)，对各块胶进行标记，小心取下凝胶并放置于准备好的的托盘内，用清水洗2．3次。(10)加入O．2％AgN03溶液500ml银染15min，震荡回收，用清水洗一次。(11)显色：称取159NaOH配制成500ml溶液，。现配现用，加入lml甲醛后立即倒入托盘内进行震荡显色，直至条带清晰为止。(12)将显色液倒掉，胶片用水清洗两次，拍照观察并封装。2．2．5PCR产物纯化和克隆测序经SSCP分型后，各纯合基因型个体PCR产物用TIANGENBIOTECH有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒纯化回收，2％琼脂糖凝胶电泳检测纯化片段。根据zhikuquan20150721TIANGENBIOTECH有限公司的pMDl9．TVector试剂盒操作过程，将经纯化的PCR产物片段连接到pMDl9．T载体上(试剂用量如表4)，转化至DH5a大肠杆菌，经鉴定后由北京华大基因有限公司测序。表4连接反应体系TabIe4ComponentsofIinkagereaction反应体系用量(91)pMDl9·TVector1．0目的基因片段4．0SolutionI5．0总量10．02．2．6数据统计分析统计各多态位点产生的基因频率和基因型频率。SPSSl9．0的一般线性模型(GeneralLinearModel，GLM)分析各基因型间在体重及屠宰性能上的差异显著性。12万方数据 3．结果与分析3．1巢湖鸭体重和屠宰性能本试验中样本的公母比例各占一半，公母群体在体重和屠宰性能指标上的均值比较见表5。公鸭群体在4周龄和12周龄体重上极显著高于母鸭(P<0．01)，但在屠宰率、半净膛率和全净膛率上极显著低于母鸭群体(P<0．01)，胸肌率显著低于母鸭群体(P<0．01)。表5巢湖鸭公母实验群体在体重和屠体性能上的差异性检验Table5TestingforthesexualdifferenceonbodyweightandcarcasstraitsofChaohuduck性状公鸭(72只)—]争酉弋葡丐D初生重46．6+3．40"——1瓦正石玎r——————一4周龄体重551．58士85．66^468．67士65．59B8周龄体重1228．24士159．13'1219．03士154．82"12周龄体重1740。74士204．88A1476．75士149．44B屠宰率88．30士5．05B91．25士2．74^半净膛率80．41士6．13B83．66士4．16A全净膛率73．12--1：6．08B76．95士4．23A胸肌率zhi10．55士1．44bkuquan2015072111．13士1．49a腿肌率13．60士1．36t13．48土I．50'Note：DifferentlargelettersBeansignificantdifferenceat0．01level，anddifferentlowercaselettersmeansignificantdifferenceat0．05level．3。2MSTN基因多态分析3．2。1基因组DNA的提取与检测取2p,1提取的基因组DNA溶液加1斗l6xLoadingBuffer在1％琼脂糖凝胶中电泳检测。检测结果见图1，可见DNA条带明亮，’效果较好，可用来进行后续实验。图1巢湖鸭血液基因组蜊A1X琼脂糖凝胶电泳FigurelAmplificationofgenomicDNAextractedfrombloodon1％agrose3．2．2PCR扩增结果引物PCR扩增检测结果见下图(2．6)，所得PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与目的片段大小一致且特异性好，可用于基因分型。万方数据 万方数据l2345678910—300bplOObpl—10：不同个体的PCR扩增产物；M为DNAmarker。1-10：IndividualPCRproducts：M：DNAmarker．图2T1扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测(大小：288bp)Figure2AnalysisofPCRamplificationonagarosegelusingTl(Length：288bp)12345678Ill300bplOObp1-8：不同个体的PCR扩增产物；M为DNAmarker。l-8：IndividualPCRproducts；M：DNAmarker．图3W1扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测(大小：251bp)Figure3AnalysisofPCRamplificationonagarosegelusingW1(Length：25lbp)23456789M300bp王00bp1-9：不同个体的PCR扩增产物；M为DNAmarker。l·9：IndividualPCRproducts；M：DNAmarker．图4W2扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测(大小：262bp)Figure4AnalysisofPCRamplificationonagarosegelusingW2(Length：262bp)200bp王00bpI-6：不同个体的PCR扩增产物；M为DNAmarker。l一6：IndividualPCRproducts；M：DNAmarker．图5们扩增产物琼腊糖凝胶电泳检测(大小：160bp)Figure5AnalysisofPCRamplificationonagarosegelusingW3(Length：160bpl14 万方数据12345678Ml-8：不同个体的PCR扩增产物：M为DNAmarker。1-8：IndividualPCRproducts；M：DNAmarker．图6N2扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测(大小：334bp)Figure6AnalysisofPCRamplificationonagarosegelusingN2(Length：334bp)3．2．3SSCP检测结果分别用以上五对引物的PCR扩增产物进行SSCP检测，各引物扩增片段的SSCP分型结果见图(7．11)。TI(图7)、WI(图8)和w2(图9)引物扩增片段均未发现多态性，由图10可知，引物W3扩增片段共检测到3种基因型，分别命名为AA、AB和BB型。引物N2扩增片段共检测到的3种基因型分别命名为DD、DE和EE型(图11)。豳燮圈图7应用引物T1对不同个体的SSCP检测结果Figure7PCR-SSCPgenotypesdetectionresultsbyusingTI图8应用引物们对不同个体的SSCP检测结果Figure8PCR·SSCPgenotypesdetectionresultsbyusingW1图9应用引物w2对不同个体的SSCP检测结果Figure9PCR-sscPgenotypesdetectionresultsbyusingW215鲻瓣，；．。避髓■．疆 万方数据髓敞AAABAA怂AAAB毳A瞻隧图10应用引物W3对不同个体的SSCP检测结果Figure10PCR'SSCPgenotypesdetectionresultsbyusingW3DDDEEEDD群蔫鬻麟鬻图11应用引物N2对不同个体的SSCP检测结果FigurelPCR—SSCPgenotypesdetectionresultsbyusingN23．2．4MSTN基因型频率和基因频率分析对巢湖鸭进行了多态性检测，其基因型频率和等位基因频率以及Hardy．Weinberg平衡妒适合性检验结果见表6和表7。分析结果表明，巢湖鸭AA基因型数量略高于BB型，AB型最少，等位基因A频率略高于等位基因B，妒检验结果表明实验鸭群基因型分布不符合Hardy．Weinberg平衡(P0．05)。表6巢湖鸭MSTN基因W3基因型频率和基因频率分析Table6AnalysisofMSTN(W3)genotype行equencyandgene舒equencyinChaohuduck注：r值右上角+}表示群体基因型分布极显著偏离Hardy·Weinberg平衡(Po．05)。Note：Z2valueswith”atthetopfightmeansthegroupgenotypedistributionsignificantlydeviatefromtheHardy-Weinbergbalance(P005)． 万方数据表7巢湖鸭MSTN基因N2基因型频率和基因频率分析Table7Analysisof．MSTN(N2)genotypefrequencyandgenefrequencyinChaohuduck注：x2值右上角”表不群体基因型分布极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0．05)。Note：gzvalueswith‘‘atthetoprightmeansthegroupgenotypedistributionsignificantlydeviatefromtheHardy-Weinbergbalance(P<0．01)：Meanswithnsatthetopfightarenosignificantdifference(P>0．05)．3．2．5测序分析结果克隆转化后，经1．5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆效果(图12)，可见各条带清晰明亮且与目的片段大小一致，说明两条片段均已克隆到质粒中，可以测序确定突变位点。克隆测序进一步证实了多态位点的存在(图13和图14)。将两基因片段纯合基因型测序结果与GenBank上的序列叫w004676457)进行比对。结果在外显予3即基因6375bp处检测到G／A突变，与GenBank序列一致的为AA型定义为野生型，突变型为BB型，杂合型为AB型；内含子2即基因5264bp处检测到T／C突变，与GeneBank序列一致的EE型定义为野生型，突变型为DD型，杂合型为DE型。400bp300bp200bp100bp图12菌液PCR鉴定克隆效果Figure12ThebacteriaPCRforevaluatingtheCloneEffectJ瓢。、磊’‘1t：AA??j，‘—i，i㈠i。，≯。1。；-’t，’j．，’∑。，，‘i，、。。s‘+1LF奠：，i、“。一(’《e’怒。j。l。≯“|i、一：。|，0．，；?。ji4．jiBBi_’≯，，。j；j”j，fc．?5、。。‘≮，"，图13从型和明型突变的测序峰图Figure13ThemutationsbetweenAAandBBgenotypes17 万方数据I)E√；一‘～一÷⋯．：．I1-．⋯——EE、，，二}’．．图14DD和EE型突变的测序峰图Figurel4ThemutationsbetweenDDandEEgenotypes3．3基因型与体重及屠宰性能关联分析采用GLM模型就公母群体不同基因型间体重和屠体性状的差异进行分析，结果以“平均值±标准差”表示(表8和表9)。在AA、AB和BB各基因型中，AA型公鸭在半净膛率和胸肌率上显著高于BB型公鸭(PO．05)。在DD、DE和EE各基因型中，公鸭各基因型间在体重和屠宰性能上差异均不显著(P>O．05)；EE型母鸭在屠宰率、半净膛率和全净膛率上均显著高于DD型母鸭(P0．05)。在合并基因型中，AADD型公鸭在4周龄体重和胸肌率上显著高于BBDD型公鸭(P0．05)，这可能与该麻鸭品种已经过前期选育有关。在基因57调控区、外显子1和外显子2上都没有发现单核苷酸多态性，这可能是MSTN基因的外显子3区域比较活跃，出现SNP的几率较高所致。一般来说，基因外显子序列相对保守，因为外显子担负着编码氨基酸的重任，外显子的突变可能会改变氨基酸序列，从而导致蛋白质结构的改变，会影响其编码产物的生物活性。另外，实验针对内含子2所设计引物是参照绿头野鸭内含子2序列(DQ419906．1)，在北京鸭基因全序列公布后，测序比对后发现N2引物所扩增片段与绿头野鸭所公布序列一致，在扩增片段范围内，北京鸭基因序列比绿头野鸭基因序列多出29bp，内含子2处其他部分序列～致。这可能反映出鸭品种间在长期进化选择中基因已出现一定的变异，而巢湖鸭与绿头鸭鸭亲缘关系比北京鸭近。4．3MSTN基因多态与生产性能的关联性MSTN是调控骨骼肌生长发育的重要细胞因子[18】。皮埃蒙特牛MSTN基因的外显子3存在一个G／A的突变，导致编码的氨基酸由半胱氨酸变为酪氨酸，造成MSTN2l 万方数据基因功能的丧失【301。Grobet等【3l】用候选位置克隆的方法证明牛的MSTN基因与双肌牛表型有关。几乎在同时，McPhetron等【32】用PCR方法扩增了比利时蓝牛MSTN基因的3个外显子，实验表明比利时蓝牛双肌型在外显子3有移码突变，结果导致不能合成有活性的MSTN而失去生物学功能。我们从中可以了解的是MSTN基因突变导致了牛的双肌表型，骨骼肌的高度发育可能是由于肌细胞中缺少MSTN的抑制作用。MSTN对动物机体的影响是多方面的，与脂肪的代谢、肌肉萎缩疾病等有关【33】。MSTN基因敲除的大鼠，与同窝的正常大鼠相比肌肉明显增加，脂肪的积聚明显较少【341。该基因第二内含子中有SNP位点(即基因5264bp处T／C突变)，研究发现各基因型间在体重、胸肌率和腿肌率上均无显著差异，这可能是由于内含子无氨基酸编码序列，碱基突变对MSTN基因表达影响较小，进而导致不同基因型在体重和肌肉发达程度上差异较小；母鸭EE型在屠宰率、半净膛率、全净膛率上是优势基因型，屠宰率、半净膛率和全净膛率是高度遗传的性状，反映出巢湖鸭母鸭EE型肌肉丰满与肥育的程度较高，体内可能含有较多的脂肪。家禽的生长发育受环境与遗传因素的影响较大，在饲养环境相同的条件下，生长发育差异较大说明其遗传基础存在一定差异[35】。基因型与体重、胸肌率和腿肌率的关联分析结果表明，MSTN基因突变对巢湖鸭12周龄屠宰性能有一定影响，对宰前各周龄活重影响不大，这可能是因为绝大部分的点突变对机体没有显著影响，而只是自然进化造成单核苷酸多态性的一种现象，MS'IN基因负反馈调节肌肉生长发育，且在各生长时期的调控作用持续存在，使得该调节对巢湖鸭体重影响不大，而对屠宰性能有一定差异性影响。公母群体间比较结果说明公鸭在体重上较母鸭占有一定优势，而在屠体性能各指标上却低于母鸭群体。该实验随机选择了巢湖鸭公母群体，尽可能地保证了实验的科学性和可操作性，在12周龄对鸭群进行屠宰测定实验也符合商品鸭出栏走向市场的规律，使得实验数据更贴近生产应用。MSTN是近些年研究发现的又一影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要因子。它通过抑制MyoD家族成员转录活性负向调控肌细胞的生长发育，其表达量与肌肉重量的变化呈负相关[36】。MSTN作为肌肉生长发育的负调控因子，因其具有潜在的重要应用价值受到了广泛重视，MSTN的活性降低或丧失，能使肌肉生长加快，相关组织的比例大大提高，因此在畜牧生产上有很好的应用前景[37】。 万方数据结论(1)巢湖鸭公鸭初生重、4周龄、8周龄和12周龄体重的“平均值±标准差”分别为46．6-1-3．49、551．58±85．669、1228．24±159．139、1740．74___204．889，母鸭依次分别为46．8+4．419、468．67±65．599、1219．03±154．829、1476．75±149．449；公鸭屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率(％)分别为88．30±5．05、80．41±6．13、73．12±6．08、10．55±1．44、13．60±1．36，母鸭依次分别为91．25±2．74、83．66±4．16、76．95±4．23、11．13±1．49、13．48±1．50。巢湖鸭公鸭4周龄和12周龄体重极显著高于母鸭，初生重和8周龄体重与母鸭差异不显著(P>0．05)，屠宰率、半净膛率和全净膛率极显著低于母鸭(P<0．01)，胸肌率显著低于母鸭(P<0．05)，腿肌率与母鸭差异不显著(P>0．05)。公鸭在生长速度上快于母鸭，但母鸭表现出较高的屠宰性能。(2)在巢湖鸭MSTN基因外显子3存在G6375A突变，在内含子2存在T5264C突变。AADD型公鸭在4周龄体重和胸肌率上显著高于BBDD型公鸭(P<0．05)，而BBDD型公鸭在腿肌率上显著高于AADD型和ABDD型公鸭(P<0．05)；ABDD型母鸭在胸肌率上显著高于AADD型母鸭(P<0．05)并且极显著高于AAEE型和BBDD型母鸭(P<0．01)，在腿肌率上显著高于BBDD型母鸭(P<0．05)。母鸭ABDD合并基因型所表现的屠宰性能相对较高。妒检验结果表明公鸭T5264C位点处于Hardy．Weinberg平衡状态。(3)MSTN基因G6375A和T5264C突变与巢湖鸭12周龄屠宰性能有较强关联性，研究结果对于巢湖鸭生产和选育具有基础性意义。 万方数据参考文献[1]CooperDN，SmithBA，CookeHJ，eta1．AnestimateofuniqueDNAsequenceheterozygosityinthehumangenome[J]．HumGenet，1985，69：201—205．[2]ReichDE，SchaffnerSF，DalyMJ，eta1．Humangenomesequencevariationandtheinfluenceofgenehistory，mutationandrecombination[J]．NatureGenet，2002，32(1)：135-142．[3]屈彦纯，邓昌彦，刘桂兰，等．单核并酸突变的检测及其在畜牧业上的应用前景．国外畜牧科技．2001，28(4)：39—42．[4]ClopA，MarcqF，TakedaH，eta1．AmutationcreatingapotentialillegitimatemicroRNAtargetsiteinthemyostatingeneaffectsmuscularityinsheep[J]．NatureGenet，2006，38(7)：813—818．[5]姜运良，李宁，吴常信，等．不同品种猪肌肉生长抑制素基因单核并酸多态性分析-遗传学报．2001，28(9)：840-845．[6]耿照玉，陈兴勇，姜润深，等．皖西白鹅催乳素基因Exon2克隆及多态性研究[J]。畜牧兽医学报．2007，38(6)：533-536．[7]魏茹华，耿照玉，姜润深，等．鹅GnRH基因5’端调控区单核苷酸多态性分析[J]．畜牧与饲料科学．2009，30(2)：127-128[8]杜晓东，张绍胜，姜润深，等．鹅IGF—I基因5’调控区单核苷酸多态性分析[J]．畜牧与饲料科学．2009，30(2)：134-135．[9]朱盼，岳理，耿照玉，等．鹅PRLR基因外显子10单核苷酸多态性分析[J]．河北农业科学，2009，13(3)：80-81，89．[10]涂小璐，姜润深，耿照玉．文昌鸡FSHB5’端单核苷酸多态性研究[J]．中国家禽．2008，30(3)：20-24．[11]McPherronAC，LawlerAM，LeeSJ．RegulationofskeletalmusclemassinmicebyanewTGF-betasuperfamilymember[J]．Nature，1997，387(6628)：83—90．[12]CheifetzS，JamesA．Weatherbee，MonicaL．一S．Tsang，eta1．Thetransforminggrowthfactor—Bsystem，acomplexpatternofcross—reactiveligandsandreceptors[J]．Cell，1987，48：409—415．[13]Gonzalez—CadavidNF，TaylorWE，YarasheskiK，eta1．OrganizationofthehumanmyostatingeneandexpressioninhealthymenandHIV——infectedmenwithmusclewasting[J]．ProcNatlAcadSciUSA，1998，95(25)：14938—149431．[14]SharmaM，KambadurR，MatthewsKG，eta1．Myostatin，atransforminggrowthfactor—betasuperfamilymember，iSexpressedinheartmuscleandiSupregulatedincardiomyocytesafterinfarct[J]．CellPhysiol，1999，180：卜9．[15]LeeSJ，McPherronAC．Myostatinandthecontrolofskeletalmusclemass[J]．CurrOpinGenetDev，1999，(9)：604—607。[16]LeeSJ，McPherronAC．Regulationofmyostatinactivityandmusclegrowth[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2001，98：9306—9311．24 万方数据[17]HillJJ，DaviSMV，PearsonA，eta1．Themyostatinpropep—tideandthefollistatin—relatedgeneareinhibitorybindingproteinsofmyostatininnormalserum[J]．JBiolChem，2002，277：40735—40741．[18]ThomasM，LangleyB，BerryC，eta1．Myostatin，anegativeregulatorofmusclegrowth，functionsbyinhibitingmyoblastproliferation[J]．BiolChem，2000，275：40235—40243．[19]DiStasioL，RolandoA．APCR—RFLPmethodforgenotypingmyostatinlocusinPiemontesecattle[J]．AnimGenet，2005，36(6)：521．[20]刘晓琴，马喜山，唐中林，等．猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析[J]．畜牧兽医学报，2013．4(7)：1063—1069．[21]李绍华，熊远著，郑嵘，等．猪MSTN基因多态性及其SNPs的研究[J]．遗传学报，2002，29(4)：326-331．[22]朱智，吴登俊，徐宁迎．鸡Myostatin基因单核苷酸多态性及其对屠体性状的遗传效应分析[J]．遗传，2007，29(5)：593—598．[23]刘艳，纽广林，张跟喜，等．肌肉生长抑制素基因57调控区的多态性对边鸡生长和繁殖性状的遗传效应[J]．中国家禽，2013，35(2)：11—14．[24]张跟喜，丁馥香，是燕萍，等．肌肉生长抑制素基因(MSTN)外显子1的多态性及其与边鸡生长性状的关联分析[J]．农业生物技术学报，2011，19(1)：122—127．[25]温彦涛，武子寅，赵振华，等．鸡MSTN基因多态性及其与屠体性状的关联分析[J]．中国家禽，2012，34(16>：30-36．一[26]顾志良，朱大海，李宁，等．鸡Myostatin基因单核苷酸多态性与骨骼肌和脂肪生长的关系．中国科学(C辑：生命科学)，2003，33：173—279．[27]卢俊清，黄苇，赵楠，等．北京鸭肌肉生长抑制素基因多态与屠体性状关系分析[J]．中国畜牧兽医，2008，35(10)：61-63．[28]岳志刚．绿头野鸭肌肉抑制素基因多态性及其与生产性能的关联性研究[硕士学位论文]．北京：中国农业科学院，2010．[29]易恒洁，李辉，杨胜林，等．三穗鸭MSTN基因多态性与屠宰性状相关性研究[J]．中国家禽，2013。35(23)：11—15_[30]KambadurR，SharmaM，SmithJP，eta1．Mutationinmyostatin(GDF一8)indouble—muscledBelgianBlueandPiedmontesecattle[J]．GenomeRes，1997，7(9)：910—916．[31]GrobetL，MarUnLJ，PonceletD，eta1．Adeletioninthebovinemyostatingenecausesthedouble-muscledphenotypeincattle[J]．NatureGenetics，1997，17(1)．7卜74．[32]McPherronAC，LeeSJ．Doublemusclingincattleduetomutationsinthemyostatingene[J]．ProcNatlAcadSciUSA。1997，94(23)：12457—12461．[33]于珊，王华岩．肌肉生长抑制因子对肌细胞发育的调控研究[J]．中国试验动物学报，2008，16：475—479．[34]McPherronAC，LeeSJ．Suppressionofbodyfataccumulationinmyostatin—deficientmice[J]．C1inInvest，2002，109：595—601．[35]张丽．北京鸭生长发育性状与血液生化指标的遗传分析[硕士学位论文]．西安：西北农林科技大学，2004．[36]李帅，杨舒黎，苟潇，等．肌肉生成抑制素(MSTN)基因研究进展[J]．中国畜牧兽医，201l，38(2)：60—63．[37]徐良梅，李仲玉，单安山．肌肉生成抑制素(MSTN)基因及其在畜牧业上的应用．东北农业大学学报，2008，39(6)：141—144．25 万方数据致谢忙忙碌碌半年的时间，硕士毕业论文终于完成!首先，我要感谢我的导师耿照玉教授，耿老师对我的关心不仅仅是学习上，生活上更是像对待自己的孩子一样，教给我很多做人的道理。耿老师的博学多识、治学严谨和亲切和蔼的态度给我留下了深刻的印象和教育，我想我与耿老师的这份师生情是永远的!其次，我要感谢我的合作指导教师陈兴勇副教授，在她的指导和帮助下使我完成了该文章。在这个过程中，陈老师不辞劳苦、不厌其烦，在论文选题上陈老师给我提出了很多的建议和指导，在写作过程中经常对我亲切提醒有关资料的收集，帮助我克服了论文写作中的困惑，并指引了写作的方向。对于论文审阅，陈老师更是进行了仔细修改，在我写作最困难的时候为我提供思路。另外，感谢姜润深教授给与我们的关怀和指导，你们是我们的恩人!感谢研究生一年级的指导老师陶勇教授和张运海教授，感谢你们对我的理解与支持，感谢你们对我的付出与关心。感谢答辩评委老师章孝荣教授、陈宏权教授、赵辉玲研究员、刘旭光副教授、刘亚副教授的支持与建议。再次，我要感谢自己的父母，感谢他们的养育之恩。25年的时间，父母提供了丰富的物质平台供我上学，一直鼓励我上学以实现自己的梦想。爸爸妈妈，我爱你们，我会好好努力不负期望的!另外，我要感谢我的妻子葛书宏在我研究生生活中带给我的快乐，对我的理解和鼓励，在学业上给与我的支持，你是我生命中最重要的人。最后，我要感谢研究生三年中所有曾经帮助过我的人。感谢安徽太养禽业有限公司在实验中给予我的帮助和所提供的便利条件。感谢我的同学们三年来带给我的快乐，感谢同门的兄弟姐妹们，尤其是家禽研究所从事研究的屠云洁副研究员，在论文修改中予以我的帮助。还要郑重感谢师兄谢珊珊、郭兴、黄龙和师姐李丽、何艳、韦培培等在实验和生活中给我的帮助和关心。感谢同实验室周丽、南花婷、夏婷婷、牛娟娟、杨乃飞、时丹、周骏、万意、张群刚、李柔、王敏、周帮园、张娇蕊和其他师弟师妹们在生活中的支持与实验中的帮助。感谢隔壁实验室朋友们尤其是刘力源在实验和数据分析上给我的指导和帮助!我还要感谢2011级10班的所有同学，谢谢他们能陪伴我走完最后一段学生生涯，能成为这个班级的一员是我一生的自豪。最后再一次感谢所有帮助过我的安徽农业大学的老师们和三年研究生生活中遇见的每一个朋友!谢谢126 万方数据作者简介燕翔，男，汉族，安徽毫州人，生于1989年lO月，2007年毕业于青岛农业大学动物科学专业，2011年考入安徽农业大学动物遗传育种与繁殖专业就读研究生。已被接受的文章：燕翔，陈兴勇，耿照玉．巢湖麻鸭MSTN基因单核苷酸多态性与体重和屠体性状的关联分析[J]．安徽农业大学学报．27