trap在评价棉花种质资源多样性中应用研究

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1、新疆农业大学硕±学{c7'论文定是等位基因编码的同功酶称为等位酶，绝大多数同功酶位点是共显性的。同功酶技术曾在六十年代至八十年代成为热点研究课题，但仅在特定组织和时期表达，并且其多态性十分有限，因此其应用受到限制。Bassiri等分别对大麦和大豆的同工酶及种子蛋白进行了多态性分析并构建了遗传图谱乜们之后。很多人试图利用同工酶与蛋白来研究甜菜的遗传多样性与遗传关系。2．4分子标记分子标记是继形态标记、细胞学标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记形式，是近十多年分子生物学技术发展的产物，它包括了分子生物学研究的多项技术如：DNA限制性酶酶切、Southern转移、分

2、子杂交、PCR技术等。DNA标记主要包括三大类：第一大类是基于DNA分子杂交的方法，主要指限制性片段长度多态性(RFLP)；第二大类是基于PCR技术的DNA扩增方法。八十年代后期，由于PCR技术的出现，不仅为基因克隆提供了十分便利的方法，也由此而产生多个新的分子标记技术。由于PCR技术简单易行，也为分子标记技术直接应用于育种实际提供了可能。基于PCR的分子标记又分为二类，一类是使用随机引物(Arbitraryprimer)，这一类方法以随机扩增多态性DNA(RAPD)为代表，它不需要预先知道任何基因组的DNA序列信息，其引物是通用的，无种属界限；另一类标记是利用特定引

3、物或引物对扩增的标记，主要有SCAR，STS、小卫星DNA(MinisatelliteDNA)；微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，又称简单重复序列(SSR)、ISSR等。第三大类是PCR与酶切相结合的方法，主要有扩增片段长度多态性(AFLP)和酶切扩增多态性序列(CAPS)。现主要介绍应用较多的几种DNA标记技术。2．4．1RFLP技术RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma，限制性内切酶片段长度多态性)由人类遗传学家BosteinD1980年首次提出乜51。RFLP技术原理是基于不同基因型间DNA序列的

4、限制性内切酶识别位点(靶位点)的差异，这种差异可能是靶位点的点突变，或DNA片段的缺失、插入、异位和倒位，从而引起酶切位点的缺失或获得，采用传统的Southern杂交很容易鉴定出这种DNA序列差异导致的多态性。其研究的方法是将样品DNA用适TR．tP钥湖E价棉花种覆资源影样性中的}移甩研究当的限制性内切酶酶切，形成不同长度的限制性片段，因为不同大小的片段在凝胶上运动速率不同，在凝胶上便形成了连续涂片，用DNA探针进行Southern杂交并放射自显影，就可得到与探针同源的DNA序列在长度上的差异。RFLP标记是DNA分子水平变异的反映，不受显隐性关系、发育阶段和环境条件

5、的影响，具有稳定遗传和特异性的特点，这些都是同工酶技术所无法比拟的。同时，RFLP标记比同工酶数量多，可产生和获得更多反映种、属遗传差异的多态性信息，为研究种间、属间甚至品种间的亲缘关系提供有利的证据。RFLP分析主要用于各种作物遗传连锁图谱的绘制和目标基因的标记。但RFLP分析是一项综合技术，涉及DNA片段的克隆、基因组DNA的提取、限制酶的消化、琼脂糖凝胶电泳、Southern印迹转移、DNA探针制备和分子杂交等一系列分子生物学技术，技术复杂，所需DNA量较大，其研究费用较高。而且RFLP分析的效率依赖于合适探针及内切酶的获得，只有选用合适的探针和内切酶，某个位点

6、才能表现出多态性，同时由于需要使用同位素，更使它的应用受到限制。2．4．2RAPD技术RAPD基本原理是采用合成的较短的单个随机引物(最常用的为10个核苷酸)，对基因组DNA进行PCR扩增，模板DNA经92—94℃变性解链后，在较低温度下(一般低于40℃)与随机引物退火，将有许多位点能与引物互补而形成双链结构。如果某两位点间的距离在可扩增的范围(约400-2000bp)之内，而且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3’端相对，就可通过PCR得到一个扩增产物。RAPD能够进行多态性检测的原理是：RAPD所用的一系列引物的DNA序列各不相同，但对于任一特定的引物，它同基

7、因组DNA序列有其特定的结合位点，如果基因组在这些区域DNA发生片段的插入、缺失或碱基突变就可以导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变。现一般都采用美国Operon公司提供的成套随机引物。标准的RAPD分析，都用琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色检测。RAPD分析所用的一系列引物的碱基序列不同，但对于任一特定引物，它与所检测的DNA序列有特定的结合位点，虽然对每一个引物而一言，其检测基因DNA多态性是有限的，但可用的引物数很多，可检测区域几乎覆盖整个基因组，所以从理论上讲，RAPD可对整个基因组DNA进行多