农杆菌介导的层出镰刀菌h10菌株遗传转化及t-dna插入突变的筛选

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1、万方数据分类号：塑三2：!密级：公珏单位代码：学号：100862011336农杆菌介导的层出镰刀菌H1O菌株遗传转化及卜DNA插入突变体的筛选彳多阳易口c纪订比m觑m色廊c钯以s-mediatedtransformationof凡，册，伽朋p加厶弦朋伽聊H10andT-DNAinsertionolmutagenesisofthef．ungus学位申请人：任洁指导教师：曹克强教授王树桐教授学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年五月二十九日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，

2、除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：t芝磁签字同期：工。J乎年‘月歹同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解通jS壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位

3、论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：名立澎导师签名：签字同期：土ol十年‘月弓日签字日期：勿节年莎月多日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：万方数据摘要㈣IlIlI㈣㈣㈣Ⅷ㈣删《

4、lIlIlY2668991节果再植病害是影响节果产业可持续发展的一个主要问题。在调查研究中发现引起再植病害的致病镰刀菌中层出镰刀菌(凡岱口，．mmp加Z掘m断m)从未报道过，本实验室前期分离得到层出镰刀菌菌株f110，而且经胚根接种试验表明，其致病力较强。本研究以层出镰刀菌菌株1110作为插入突变的原始菌株进行T—DNA插入突变。在建立突变体库之前，对农杆菌介导的转化体系进

5、行了优化，包括孢子浓度，农杆菌oD。值，共培养温度，共培养时问等。然后经过潮霉素和PCR鉴定，外源的T—DNA成功整合到病原菌的基因组中。根据已建立的优化体系得到了包含1109个转化子的突变体库，并且完成所有转化子的单孢分离，并保存。随机选取突变体进行形态观察，并进行产孢分析，并通过胚根接种方法进行致病性测定。取得的研究结果如下：1、对适合层出镰刀菌菌株HlO产孢培养基进行筛选，包括CYM、VBC、ATcC、BPY和TYG，结果发现在BPY培养基上接种96h后产孢达到102．33×10’个／mL，240h后达到306．83×105个，mL，BPY产孢量能够保证试验对孢子的需求量

6、，因此把BPY作为促进产孢的培养基。2、H10对潮霉素敏感性测定表明，在含有100u咖L潮霉素的培养基上H】O菌株的菌丝及孢子都不能生长，确定筛选潮霉素浓度为100u∥mL。3、对抑制农杆菌生长的头孢霉素浓度进行筛选，发现200u∥mL浓度能够完全抑制农杆菌生长。4、大规模构建突变体库前，对转化的体系进行优化，优化后的体系转化效率明显提高。优化后的最佳条件为：农杆菌浓度OD600为0．3，孢子悬浮液浓度为107个／mL，共培养时间为48h，共培养温度为26℃，As浓度为600umol／mL。5、经潮霉素和PCR鉴定，突变菌株在含有100u∥mL潮霉素的培养基上能够生长，PcR能

7、够扩增出目的条带，连续转接5代并回接到含潮霉素的培养基上能够稳定遗传，表明外源基因已经插入基因组中。6、对得到的突变体随机挑选，进行形态、产孢量、致病性等进行测定，菌株颜色大都发生变化，产孢量及形态发生改变，致病性也减弱。关键词：层出镰刀菌；农杆菌介导的遗传转化；突变体；致病性万方数据爿∥．D加c耙r胁朋胁朋乞加以Ⅲ争mediatedtransformationofJⅥ硼胁，埘p加艇膨r口mmH10andT—DNAinsertionolmutagenesisofthefungusAuthor：RenJieMajor：P】antPathologySupeⅣisors：Pmfess

8、orCaoKe-qiangprofbsorWangSbu—tongAbstractAppleR印1antDisease(ARD)，distnbutedinallovertheappleproducingareasaroundthenationwide，iscausingseriouseconomiclossestofIanllers．ItisalsoaseriousthreattothesustainabledeVelopmentofappleindustry．OurearIierinVes