副猪嗜血杆菌分离鉴定及血清学分型方法的建立

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1、农学硕士学位论文副猪嗜血杆菌分离鉴定及血清学分型方法的建立路明华河北工程大学2014年5月分类号：$852．6UDC：农学硕士学位论文密级：公开单位代码：10076副猪嗜血杆菌分离鉴定及血清学分型方法的建立作者姓名指导教师申请学位级别学科专业所在单位授予学位单位：路明华：王雪敏教授王宏俊副研究员：农学硕士：动物遗传育种与繁殖：农学院：河北工程大学ADissertationSubmittedtoHebeiUniversityofEngineeringFortheAcademicDegreeofMaste

2、rofAgricultureIsolationandIdentificationandEstablishmentofSerologicalTypingMethodsofHaemophi／usCandidate：LuMinghuaSupervisor：Pro．WangXueminandAcademicDegreeAppliedforSpecialtyCollege／Department：AssociatePro．WangHongjunMasterofAgricultureAnimalGenetics．B

3、reedingandReproductionScienceAgriculturalCollegeHebeiUniversityofEngineering一May2014独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰堡王堡盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识

4、到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：嬲拜签字日期：P／9年，月凇日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰竖墨堡太堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权塑兰垦王堡盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作导师签名：者签名：罄砜拜趸锄签字日期：№肜年j月落日签字日期：沙辱年岁月‘坊IS摘要副猪嗜血杆菌(Ha

5、emophilusparasuis，H．parasuis／HPS)是一种不运动的具有多种形态，严格依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(也称之为V因子)的革兰氏阴性小杆菌，是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)的成员，也是猪革拉泽氏病(Glasser’Sdisease)的病原菌，猪纤维浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎是该病主要特征，主要引起保育仔猪和幼年猪群发病和死亡。随着我国养猪业的发展和集约化水平的提高，副猪嗜血杆菌感染越来越多，该病己流行于世界多数国家和地区，表现出

6、猪只突然死亡，发病率和死亡率均较高，给养殖企业造成巨大经济损失，严重危害养殖业的发展，是全球养猪业的一个巨大的难题。目前在国内尚未有用于分型的商品化标准血清，因此，开展分型血清的制备和分型方法的建立对快速确定分离株的血清型和进行相关治疗就显得尤为重要。首先，本实验从华北地区疑似副猪嗜血杆菌感染的猪场采集了多种病料，通过使用TSA培养基，成功分离到19株细菌；进一步纯化后进行了细菌形态学观察、培养特性和生化鉴定，种特异性PCR也扩增出1090bp的目的片段，证明19株分离株均为副猪嗜血杆菌。进一步对分离

7、株的药物敏感性、致病性和毒力基因进行了研究，发现19株分离株具有除GS一3外都具有强致病性和多重耐药性，但是对大环内酯类类抗生素仍很敏感，这对华北地区猪场该病的防制提供了用药指导；对潜在毒力基因的扩增结果也与小鼠感染实验结果相符，证明nhaC,hhdA和hhdB基因可能与1t．parasuis的毒力有关，而砀删并非毒力基因。其次，实验中我们通过将副猪嗜血杆菌15个参考菌株在TSA固体培养基上进行培养，扩大培养后用PBS将菌体从培养基上洗下来，灭活后用于免疫白兔，抗体产生后采血制备了15个血清型的抗血清

8、。用琼脂扩散试验检验了抗血清的交叉反应性，玻片凝集法测定了抗血清的效价。根据交叉反应的结果，采取交叉吸附的方法制得了15个血清型的单因子血清。用单因子血清对分离得到的19株／／．parasuis分离株进行血清型的分型，结果表明，19株分离株均能被准确分型。又用单因子血清琼扩试验和间接血凝试验对本实验室早期分离的四株副猪嗜血杆菌进行了分型，间接血凝试验分型结果均有交叉反应，无法定型；而单因子血清可以对四株分离株准确分型。表明所建立的单因子血清琼扩分型法具有