甘氨酸对缺氧复氧心肌细胞[ca2+]i和tnf-浓度的影响

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1、中国病理生理杂志
ChineseJournalofPathophysiology
2004,20(4):571-574)571)[文章编号]
1000-4718(2004)04-0571-042+甘氨酸对缺氧/复氧心肌细胞[Ca]i和TNF-
浓度的影响#李晓娟,
陆大祥,
王华东,
戚仁斌,
王彦平,
李楚杰(暨南大学病理生理学教研室,广东广州510632)

[摘
要]
目的:观察甘氨酸对缺氧/复氧心肌细胞内游离钙、心肌细胞存活率和TNF-
浓度的影响。方法:利用原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞建立心肌缺氧/复氧(H/R

2、)模型,实验分7组:对照组;!缺氧/复氧(H/R)组;∀0
5mmol/L甘氨酸(GLY)+H/R组;#1
0mmol/LGLY+H/R组;∃2
0mmol/LGLY+H/R组;%4
0mmol/LGLY+H/R组;&4
0mmol/LGLY对照组。结果:在一定浓度范围内(0
5-2
0mmol/L),甘氨酸能抑制缺氧/复氧损伤引起的细胞内钙超载,并呈现剂量依赖性关系,在2
0mmol/L浓度水平,达到最佳抑制效应。甘氨酸能抑制心肌细胞产生TNF-
,避免心肌H/R损伤的加重,增加心肌细胞的存活率。结论:甘氨酸对缺氧/复氧心

3、肌具有保护作用,其机制与抑制钙超载,减少TNF-
的生成有关。[关键词]
缺氧;甘氨酸;肿瘤坏死因子

[中图分类号]
R363




[文献标识码]
A

随着人们生活水平的提高和生活节奏不断加自杭州四季青生物制品所;胰蛋白酶为Hyclone产快,冠心病等心肌缺血性疾病的发病率呈上升趋势,品;Fura-2/AM购自美国Sigma公司;TNF-
ELISA目前改善心肌缺血最理想的方法是尽早恢复组织的试剂盒购自晶美生物工程有限公司;EGTA购自威佳血液灌流,然而再灌注导致部分机体心肌损伤的加科技有限公司;甘氨酸购自展晨生物科

4、技有限公司;重便成为缺血性疾病防治中所要解决的重要问题。其余试剂均为市售分析纯产品。Hanks及D-Hanks2+[4]

Ca作为细胞生命活动中信息传递的第二信溶液按鄂征的方法配制。荧光分光光度计:日本使,是维持心肌细胞功能的重要因素,心肌受损时,产RF-5000型(Shimadzu)。将0
5mgFura-2/AM细胞内游离钙浓度升高,出现钙超载;同时心肌细胞溶于0
5mL二甲基亚砜(DMSO),分装后-20∋保自分泌肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-
),加重存备用。心肌细胞损伤。本实验室先前的研究

5、发现,甘氨酸2
方法能够减轻内毒素[1]引起的心肌损伤、对抗垂体后叶2
1
心肌细胞培养
出生1-3dSD大鼠乳鼠20[2][3]只,无菌条件下取出心脏剪碎,0
125%胰蛋白酶分次素诱导的心肌缺血性和缺血-再灌注性损伤。本实验通过建立体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复消化成单细胞悬液,离心收集沉淀,用含15%胎牛血氧模型模拟在体的心肌细胞缺血-再灌注损伤,通清的DMEM培养基悬浮分散细胞,100目筛网过滤,过心肌细胞[Ca2+]i、心肌细胞存活率和TNF-
浓将细胞悬液接种于25mL培养瓶中,在CO2孵箱中度的测定,观察甘氨酸

6、对缺氧/复氧心肌细胞的保护(95%O2,5%CO2,37∋)培养90min后,弃去贴壁的作用,为临床缺血性疾病的防治提供理论依据。成纤维细胞,置换细胞悬液于另一培养瓶中,每24h换液1次,48h时,心肌细胞已成片搏动,用0
125%材
料
和
方
法的胰蛋白酶消化,加入含15%胎牛血清的DMEM培1
材料养基终止消化后离心弃上清,再加入含15%胎牛血

新生1-3dSD大鼠由广东省实验动物中心提清的DMEM培养基吹打细胞,经0
4%台盼蓝染色检9测心肌细胞存活率>90%,制成1
5(10cells/L的细供;DMEM培养基购

7、自美国Gibco公司;胎牛血清购胞悬液,然后加入终浓度为1
0mol/L的Fura-2/AM于37∋负载45min,取出离心去上清,再用
[收稿日期]2003-12-15

[修回日期]2004-02-14Hanks液清洗细胞两次,洗去细胞外的Fura-2/AM[基金项目]广东省重点科技项目(No.2KM04703S);广东后进行模型复制。省社会发展公关项目(No.2002C30102)[5]通讯作者Fax/Tel:020-85220004;E-mail:ldx@jnu.edu.cn2
2
心肌细胞H/R模型的建立
预先

8、用高纯氮#新乡医学院委托培养硕士研究生气(99
9%)饱和D-Hanks液,通气持续时间>40)572)min,测血气PO2∗4
0kPa即为低氧液;用纯氧结

果(99
9%)饱和Hanks液(通气持续时间>40min),即为复氧液。用低氧液置换正常培养液,并于培养瓶1
甘氨酸对H/R心