2016新课标创新人教生物选修1 专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离

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1、一、蛋白质提取、分离1．蛋白质分离的理论依据2．凝胶色谱法(分配色谱法)(1)概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(2)分离原理相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。3．缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内的缓冲液。4．

2、电泳(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。(2)原理①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。二、血红蛋白的提取和分离1．样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。②过程：分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸出上层

3、透明的黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。(2)血红蛋白的释放①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。②过程(3)分离血红蛋白溶液：离心(以2000r/min速度，离心10min)→观察到离心管中的溶液分为4层，从上往下依次为：第1层：无色透明的甲苯层。第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。2．透析——粗分离过程：取1mL的血红蛋白

4、溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol·L－1的磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，透析12h。3．纯化——凝胶色谱操作制作凝胶色谱柱―→装填凝胶色谱柱―→样品的加入和洗脱。4．纯度鉴定鉴定方法中使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。[共研探究]生物体内的蛋白质多种多样，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子之间的差异来分离的。1．凝胶色谱法(1)分离蛋白质的过程(如图B)①蛋白质混合物上柱。②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分

5、子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动。④相对分子质量不同的分子完全分开。⑤相对分子质量较大的蛋白质已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。(2)凝胶色谱法的原理相对分子质量大相对分子质量小直径大小较大较小运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动路程较短较长运动速度较快较慢洗脱次序先流出后流出2.缓冲溶液(1)概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变的溶液。(2)缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常

6、由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。3．电泳(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。(2)原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用方法①琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖本身不带电荷，由于各种分子带电性质、分子大小和形状的不同，在电场中迁移速率不同，从而得以分离。②聚丙烯酰胺凝胶电泳a．SDS：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；b．SDS能与各种

7、蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。[总结升华]凝胶色谱法和电泳法的比较凝胶色谱法电泳分离依据相对分子质量大小分子带电性质差异、分子大小和形状等分离动力重力电场力分子大小的影响相对分子质量大，移动速度快分子大，阻力大，移动速度慢[对点演练]1．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为(　　)解析：选B　凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有

8、效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。2．下列关于电泳的叙述，不正确的是(　　)A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳