生物选修一5-3血红蛋白的提取和分离

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1、课题3血红蛋白的提取和分离一.蛋白质分离和提取的原理分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度吸附性质对其他分子亲和力根据蛋白质各种特性的差异：（一）凝胶色谱法2）材料：凝胶(分配色谱法)1）概念根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而维持pH稳定。（二）缓冲溶液（三）电泳1)概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2)原理

2、利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3)类型:琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳4)实例：SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳用途:测定蛋白质的分子量鉴定蛋白质的纯度5)原理：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。血液组成成分血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是__________。该化合物是由_________和

3、__________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链亚铁血红素本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：洗涤红细胞；血红蛋白稀释;离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二.实验操作阅读思考：洗涤的目的是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆5倍体积

4、生理盐水红细胞搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色红细胞的洗涤除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。血红蛋白的释放阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？目的分析：蒸馏水的作用是___________________________。加入甲苯的作用是_________________________。充分搅拌的目的是_________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂红细胞破碎混合液高速离心10min脂类物质分离血红蛋白溶液滤纸过滤取1ml的血红蛋白

5、溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时除去样品中分子量较小的杂质①过程②透析目的透析纯化——凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱①凝胶的选择：交联葡聚糖凝胶（G-75）②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液③凝胶色谱柱的装填方法:A、固定B、装填注意事项？为什么装填凝胶柱时不得气泡存在？答：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果2.凝胶色谱柱的装填④洗涤平衡注意：液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物

6、质的分离效果。注意：正确的加样操作（1）不要触及和破坏凝胶面（2）贴壁加样（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。3.样品的加入和洗脱讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即

7、样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？教学反馈1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差

8、异BBBB5．血液由血浆