蓝太阳鱼生长激素全长cdna的克隆、表达研究及转基因的分析

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1、曹运长中山大学博士学位论文2004年5月蓝太阳鱼生长激素全长cDNA的克隆、表达分析及其转基因研究专业：生理学博士生：曹运长导师：林浩然院士摘要蓝太阳鱼(greensunfish，Lepomiscyanellus)为北美小型淡水鱼类，具有良好的养殖前景，由于其存在个体较小，生长速度较慢等问题，造成大规模养殖经济效益低下。本文通过对与蓝太阳鱼生殖生长密切相关的内分泌激素一一生长激素基因进行研究，试图从分子水平和组织细胞水平了解太阳鱼生殖生长的一些规律。同时，通过构建“全鱼”生长激素基因，以期通过转基因技术培育出生长快速的转基因蓝太阳鱼。主要研究内容

2、包括：1．采用RT-PCR法和3’、5’RACE(RapidamplificationofcDNAends)技术从蓝太阳鱼脑垂体总RNA克隆出生长激素全长cDNA。此cDNA全长992nt(含poly(A)尾)，其5’端非编码区长93nt，开放阅读框(Openreadingframe，ORF)长615nt，3’端非编码区长224nt。由其推导的GH全长为204个氨基酸，由前17个氨基酸的信号肽和后187个氨基酸的成熟肽组成，分子重量为23KD，等电点为7．4，有四个位置非常保守的半胱氨酸，形成两个二硫键。与其它鱼种GH进行基因序列和氨基酸序列比较

3、分析表明，它与近源鱼种有较高的同源性，与同一鲈形目石斑鱼(Epinepheluscoioides)、金头鲷(Sparu$aurata)、罗非鱼(Oreochromisniloticus)的核酸序列相似性分别为90．34％、90．08％、86．05％，氨基酸序列相似性分别为97．1％、94．6％、87．8％。蓝太耀鱼生长激豢全致eDNA瓣竞建、表达分错艇菇转基因研究同时对脊椎渤物的GH分子进行了系统进化分析。2。应羽半定量RT-PCR方法，系统建疆究了GH基黧在鱼类菱傣外组织中的表达情况。对蓝太阳鱼幼鱼和成鱼的12个组织中GHmRNA的表达情况进行

4、了检测，结果表明，除了垂体外，在其它许多组织如腿疼、洼骧、鳃、。§驻、麓、弩等逸存在羞G馘mRNA靛广泛表达，假表达水平比垂体要低，同时观察到在幼鱼和成鱼的性腺组织存在整较高水平的液达。由此提示，蓝太阳鱼GH以旁分泌或臼分泌的方式鼹夔太麓受躺生长繁臻发育起重要鼹终爱。3．应用细胞组织举方法对菔太阳鱼的胚胎和仔鱼的发育进行了观察，结果表明，水温在25+1℃时，从受精到孵化期只需约30小时，扶鼹凭麓到摄食鬟为4天左右，魄大多数淡承焦类数艇耱发弯要炔。此外，发现经过脱膜处理或低温(6-8℃)处璁(时间不麓过2h)的受精卵的发育并没有受到影响。同时应用组

5、织切片技术对蘸太阳鱼的饿艨发育霹露逑牙了磅突。结果发瑷，在三月龄蛙，雌雄藏太阳鱼发努副第1I期，在四月龄时，雌雄都发育到第1ll期，在5-6月龄时，发静到第1v期，在7—8月龄时，达到性成熟第V期。过冬时，雌鱼退化到麓ll期，露攘鱼锈每整在第V麓。鞲巢帮卵巢发育都为不懑步型，且精巢发育陇卵巢稍快。作者从生熊和生长的荧系上对蘸太阳鱼生长缓慢的原因进行了探讨。4。暴热显徽注射法将掇告基鞭GFP基霪等入蕴太潮鱼受精赛中，研究了外源基因在鱼类胚胎发育过程中整合与表达的时痔。结桑表明GFP在原肠末期开始袭达，一直到鱼苗期并来出现表达鬣的衰减，并袋瑷为嵌会经

6、表这稳缌织特异蛙袋达。终源麓因在受钵审鹣表达率与罄因构型和注射剂量衬美，环形质粒的表达瑟略高于线形质粒，较蕊注射剂量的外源基因的表达率比低剂量的要商。同时将GFP基因与“全篷”基因黧缀子进{亍了共转移，搽讨嚣静独立豹羚源基缀在蓝太掰镄中整合或表达行为的关系，结果袭明两种独立的基因在受体中的整合成表达没前必然的联系。5。逶避蓉嚣重缀，婚石斑惫生长激素慧爨缡码穿梦lj克隆至l鳃夔Ⅱ曹运长中山大学博士学位论文2004年5月B-actin基因启动子下游，构建了“全鱼”生长激素基因表达载体pCAecGHc。通过显微注射将重组基因CAecGHc导入了蓝太阳鱼

7、受精卵中，研制了转基因蓝太阳鱼。经过PCR、Southern杂交、斑点杂交、RT-PCR等技术对转植基因在转基因蓝太阳鱼中的整合和表达情况进行了检测，结果表明，转植基因CAecGHc在原代转基因蓝太阳鱼中的整合率为5．60％一12．26％，并在转基因鱼中得到了正确表达，表达表现为嵌合性。同时对转基因蓝太阳鱼的生长表型效应进行了对照养殖实验，初步显示生产的转基因蓝太阳鱼具有较快的生长速度，比对照组生长速度快20％一40％左右。6．应用近交策略培育出了两个转CAecGHc基因蓝太阳鱼Fl代品系，采用PCR技术、Southern杂交技术对转基因Fl代品

8、系的整合情况进行了检测，转植基因CAecGHc在两个品系的整合率分别为22．03％和40．8％。结果表明转植基因通过生殖链传递给了子代，