利用生物工程技术创造甜菜耐盐新种质

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1、山东大学博士学位论文利用生物工程技术创造甜菜耐盐新种质姓名：杨爱芳申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：张举仁20031105原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名:聋业土一日期:7.004.ii.J.关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送

2、交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名14牛导师签名:澎犯日期:20咔u,S.山东大学博士学位论文利用生物工程技术创造甜菜耐盐新种质摘要甜菜(Beta。妙risL.)是重要的糖料和饲料作物，糖用甜菜提供了全球40%以上的食糖，饲料甜菜是家畜最佳的多汁饲料，块根肥大，营养丰富。甜菜具有耐盐潜质，能在盐分低于0.4%的土壤中正常生长。甜菜的一些近缘野生种起源于滨海，耐盐性较强。饲用

3、甜菜虽生物量大，耐盐性却不高。因此，高耐盐性饲用甜菜的开发和利用，不仅可充分开发利用滨海盐碱地，推动养殖业发展，而且能有效改善生态环境。采用常规育种技术培育甜菜耐盐品种周期长，见效慢，至今还没有培育出适合滨海盐碱地种植的品种.采用生物工程技术可以获得耐盐性大幅度提高的工程植株，并能缩短育种年限，这为甜菜耐盐育种开辟了新途径.通过耐盐细胞突变体筛选等技术，可创造出甜菜耐盐新种质。采用转基因技术，可将从细菌和盐生植物中克隆的耐盐基因导入甜菜，获得高度耐盐的优良甜菜新种质。本论文的目标就是综合利用细胞工程和基因工程技术，培育适合在我国中低度滨海盐碱地中种植的耐盐

4、饲用甜菜新品系。以14个甜菜品种的幼胚、叶柄和沙培小苗下胚轴切段为材料，分别诱导愈伤组织并继代培养。研究了影响愈伤组织诱导频率的因素，对愈伤组织继代培养及分化的条件也进行了探索.发现同一基因型甜菜的不同外植体的愈伤组织诱导率存在差异。幼胚较易产生愈伤组织，下胚轴、叶柄、叶片则较难。不同基因型的外植体，愈伤组织诱导率有明显差异。外植体的发育时期和生理状态对愈伤组织的诱导有明显影响。经过多次继代培养，从4个基因型的幼胚得到了颜色为乳白或淡黄、结构疏松、颗粒状的胚性愈伤组织.胚性愈伤组织在MS十5%蔗糖附加0.05m叭ABA或附加。.05mg/LZT+0.05m

5、叭ABA的分化培养基上通过胚状体发生途径再生植株。不同基因型材料再生植株的最适培养基组合有差异。从下胚轴和叶柄诱导的愈伤组织由于诱导率低且继代培养难度大，只得到了少量胚性愈伤组织，未能获得再生植株。部分胚性愈伤组织经5^-20Gy剂t的60C。一Y射线辐照后，在附加不同浓度盐分(1.0%^'2.5%NaCI)的培养基上连续筛选三代，获得稳定耐1.5%NaCl的耐盐山东大学博士学位论文细胞系。在分化培养基上耐盐细胞系通过胚状体发生途径再生耐盐植株。再生植株自交后代(Rl)播种在沙盆中，每天浇灌2.0%^-3.0%NaCI水溶液。有18个株系可在2.0%NaC

6、l溶液中长期生长，6个株系在2.5%浓度下能萌臀但在生长过程中因盐害影响而下胚轴枯死，植株死亡。对照在2.0%NaCl溶液筛选中没有存活苗。这些结果表明以甜菜愈伤组织为材料，通过辐射诱变和定向筛选创造甜菜耐盐育种材料是可行的.以20个基因型甜菜的幼嫩花序顶端切段为外植体，在附加lm叭6-BA的MS培养基上诱导不定芽发生。3周后不同基因型的花序切段均有不定芽发生，诱导率达到90%以上.花序切段产生不定芽的速率随基因型而异，一般在接种后10^-20天发生。随着培养时间的延长，不定芽大量产生，密集成丛。将丛生芽块剪成小块继代培养，每15天继代一次。继代培养3次后

7、，每代每个芽可产生5^-8个次生芽，芽的增殖频率为每月1:20^30或更高。切下丛生芽块上较大的单芽，在附加lm叭NAA的生根培养基上诱导生根。一般两周内白色粗壮的根发生，生根率50^80%。生根率与芽的年龄、大小及生理状态有关，生长较快的大芽易产生根系。生根植株移栽到花盆，新根系产生后定植于大田。甜菜丛生芽发育的小苗生根率因基因型不同而有明显的差异，一般在75%以上，少数基因型的试管苗移栽成活率高达98%.将继代培养过程中旺盛增殖的丛生芽块剪成小芽，经10^20Gy剂量的60Co-Y射线辐照，结合1.0%^2.5%NaCl的直接筛选，获得了耐2.0%Na

8、Cl的小丛生芽并再生植株。再生植株自交后代(R,)播种在沙盆中，浇