利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究

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1、1Illllllllllllll[j982t本人声明：所呈交的’≯位论文足小人化导!Jjlj的指导卜-进{J：的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文·l，／fi包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内苤直太堂及其他教育机]：；．jfl‘j。≯化或证书In“止川过的材料。与我⋯l司]一：作的同志对本研究所做的任何贡献均已征沦文IlIft厂⋯确的说l{JJji：太，J÷谢意。学位论文作者签名：]墨垒垒指导教师签名：学位论文作者签名：!坚兰：兰指导教师签名：I：1期：!!!：0『_I期：在学Jg]f,JtiJI：究成果使用承讲-I5小学位论文作者完个了解

2、学校仃父倮17f、使川学f节论义的规定，即：内蒙tii-人学有权将学位论文的全部内容或部分保健例：向⋯家仃天机构、部I’j送交学位论文的复印件和磁盥，允许编入有关数据库进行检索，也可以采川影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者拒学jUJI"lJⅡ义得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期

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5、一盈簦利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究摘要作物生长、产量和质量受土壤盐渍化限制，已成为世界上的一个普遍问题。紫花苜蓿(MedicagoSativaL．)是一种优良的豆科牧草，蛋白质含量高，维生素和矿物质含量丰富，氨基酸种类齐全，且适口性好，在我国北方地区的农牧业生产和生态建设中发挥极其重要的作用。然而，多数紫花苜蓿品种耐盐能力差，不合适在盐碱地种植。因此，培育合适在盐碱地种植的耐盐丰产的紫花苜蓿新品种，充分利用盐碱地，提高牧草产量，是发展农牧业经济和改善生态环境的有效途径。现代生物技术育种的迅速发展，为培育新的品种提供了高效快捷的方法。本研究选择紫花苜蓿阿尔冈金品种为材料，

6、通过转基因技术对其进行了耐盐性遗传改良，获得了耐盐性提高的新种质。主要研究结果如下：1、对紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期和苗期的耐盐性分析，结果表明225mmol／L和300mmol／L的NaCl浓度分别是发芽期和苗期耐盐性筛选的适合浓度。2、利用花粉管通道法将盐生植物红树(RhizophoraapiculataL．)总DNA导入紫花苜蓿，获得12株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照，对12株耐盐植株进行RAPD分析，条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失。分析引物S178和引物S198在植株Ms．ra3中出现的供体特异条带和新增条带序列，初步证实外源DNA已经整合到

7、受体的基因组中，而且To代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关。移栽To代耐盐植株至实验地，人工辅助同株白交授粉，获得T1代种子。225mmol／LNaCl筛选获得T1代幼苗，T1代幼苗经300mmol／LNaCl胁迫后测定耐盐相关生理生化指标，结果表明Tl内蒙古大学博士学位论文代植株耐盐性明显增强。T2代幼苗经O．6％NaCl胁迫处理21d，获得了T2代耐盐株系。3、比较分析了培养基成分(MS培养基、UM培养基、SH培养基)和激素配比对阿尔冈金品种下胚轴、子叶和子叶节再生的影响，发现子叶节在添加3．0mg／L6-BA的SH培养基上适宜遗传转化，生根培养时添加0．5mg／LIBA

8、。在此基础上，本研究通过农杆菌介导法首次将盐生植物盐角草(SalicorniaeuropaeaL．)Na+／H+逆向运输蛋白基因SeNHXl导入阿尔冈金，PCR检测获得36株T0代转基因植株，移栽温室培养获得6株生长旺盛的植株。RT-PCR检测显示SeNHXl基因在5个转基因植株中获得了表达。0．6％NaCl胁迫表达外源基因的5个转基因植株扦插苗后测定耐盐相关生理生化指标，结果表明这5个转基因植株的多数耐盐相关生理生化指标均优于对照，而且有1个转基因植株(胁讣mX75)所测定耐盐相关生理生化指标均优于其他转基因植株。加代培养获得T，代植株，经PCR鉴定筛选获得了T1代转基因株系。4、

9、首次克隆了紫花苜蓿阿尔冈金盐诱导表达基因MsPRP2启动子序列，大小为1521bp，与GenBank中报道的序列(AF028841)的同源性为93．7％，且含有2个大的AT富含区和1个G．box。成功构建了盐诱导型启动子驱动SeNHXl基因的植物双元表达载体pPZP221(MsPNN)，并利用农杆菌介导法转化紫花苜蓿阿尔冈金，获得转化再生植株。关键词：紫花苜蓿；花粉管通道法；红树；&脚；耐盐种质；MsPRP2启动子Ⅱ摘要DEVELOPINGNEWGERMP