中东呼吸综合征冠状病毒受体结合的分子机制研究

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1、喾短狄学硕士学位论文密级；保密期限：中东呼吸综合征冠状病毒受体结合的分子机制研究T垣olecularmechanismofbindingbetweennoVelhumancoronaVirusM匮RS-CoVanditsreceptor学号姓名学位类别学科专业(工程领域)指导教师完成时间答辩委员会主席签名D201102082胡亚伟理学硕士生物学严景华高福研究员院士2014年5月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外

2、，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文储张媳可年鳓期：抄／垆年6月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论

3、文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)导师签名：签字日期：日，丐矽，^y以7俾垃q如器山轰可月讯6：年名尹签订利办作：文期沦日鲥字学签摘要冠状病毒(cD阳，z以y抛s)是一类广泛存在的、对人及家畜具有重大潜在威胁的病原体。该种病毒具有广泛的组织亲嗜性，是所有对蛆病毒中基因组最大的病毒(基因组约有30kb)。2012年9月在中东发现的中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEaStrespirato巧sylldromecoronavims，MERS．CoV)可以引起人体严重的肺部疾病，其临床表现为急性呼吸

4、窘迫综合征，并伴有多器官功能衰竭，是继SARS．CoV之后的第二大高致病性冠状病毒。该病毒自2012年9月被确认，截至今年5月8日，共有536例确诊病例，死亡率高达30．7％。因此，MERS．CoV已经成为一种严重威胁人类健康与生命安全的新型冠状病毒。国际病毒分类委员会(TheIntematiomlCommitteeonTaxonomyofⅥ11lses，ICTV)将冠状病毒分为四个属：a，p，Y和6冠状病毒属。p冠状病毒属中有四个亚群(A-D)，通过比对MERS—CoV和其他B冠状病毒基因序列发现，M

5、ERS．CoV与SARS．CoV中较为保守的核酸复制酶序列仅有小于50％的氨基酸相同，而与从蝙蝠分离到的HKIM和HKU5亲缘关系更近，因此，ICTV将MERS．Cov归为p冠状病毒属C亚群的一个新种，也是第一种能感染人类的C亚群B冠状病毒，而SARS—Cov则属于D冠状病毒属B亚群。刺突蛋白(Spil(eglycoprotein，S)是冠状病毒表面参与受体结合、膜融合和病毒侵入宿主细胞的主要膜蛋白，也是宿主中和性抗体的主要靶分子。成熟的S蛋白通常会在宿主蛋白酶的作用下裂解成两个亚基：S1和S2。其中，

6、S1负责受体的识别，而S2启动病毒与宿主的膜融合。S1亚基又包括两个相对独立的区域，N．端结构域(N．teminaldomain，NTD)和C．端结构域(C—tenninaldomain，CTD1，不同的冠状病毒通常利用这两个结构域之一作为病毒的受体结合区(recepterbindingdomain，RBD)。S蛋白与病毒的高致病性密切相关，也是宿主选择性的决定性因素之一。有研究表明，冠状病毒的S蛋白能够识别细胞表面的蛋白和一些糖脂的糖基，如5．N．羟乙酰神经氨酸和5．N．乙酰神经氨酸等，作为病毒的受体

7、或共受体。目前已有两类宿主酶蛋白被鉴定为冠状病毒的受体，包括血管紧张素转换酶2(ACE2)作为SARS．CoV和人类冠状病毒HCoV二NL63的受体，氨肽酶N(APN)作为猪呼吸冠状病毒PRCV的受体。有关这些受体和病毒中东呼吸综合征冠状病毒受体结合的分子机制研究S蛋白的相互作用模式都得到了详细的阐述。我们首先利用哺乳动物细胞表达了MERS．CoVS蛋白的Sl亚基、S1亚基的NTD和CTD的Fc融合表达蛋白。用流式方法检测了这三种蛋白与表达在BHK细胞表面的CD26分子的结合。结果显示S1蛋白和S1蛋白

8、的CTD结合CD26分子，而Sl蛋白的NTD不结合。这表明MERS．CoVS蛋白的受体结合区位于S1蛋白的C端，由此我们将该区域定义为MERS．CoVRBD。然后，我们用杆状病毒表达系统表达了MERS．CoVRBD蛋白，并解析了其晶体结构。结构显示MERS．CoVRBD结构由一个核心区和一个外展区域构成，核心区与先前解析的SARS．CoV的RBD有极高的结构相似性，而外展区结构则完全不同。我们进一步用杆状病毒表达系统表达了CD26的胞外段蛋