脓汁和粪便标本中病原菌的检测

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1、器材准备斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。染色瓶6组，染色架8个。医学微生物学实验综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）斜面培养物的观察革兰染色法肉汤接种法显微镜油镜的使用斜面培养物的观察分别从斜面的正面和背面观察。从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红

2、）。※为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色，紫黑色或粉红色。从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。细菌染色法单染色法：只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。复染色法（鉴别染色）：采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极

3、体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。结核分枝杆菌抗酸染色麻风分枝杆菌抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜Hiss染色破伤风梭菌芽胞芽胞染色变形杆菌鞭毛Leifson染色白喉棒状杆菌异染颗粒Albert染色革兰染色法GramStaining革兰染色法是丹麦内科医生ChristainGram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。革兰染色法原理的三种学说通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道

4、屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。革兰染色的意

5、义鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。选择抗菌药物：G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤涂片→干燥→固定→染色接种环取生理盐水3～4ul，2滴。菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成≥1cm2。涂毕→环移至涂膜中央侧立，环内菌膜破裂，接种环→灭菌。涂片的制备甲→黄色，紫黑。乙→黄色，紫黑。丙→白色，粉红。丁→白色，粉红。涂片涂片干燥固定革兰染色方法步骤涂片→干燥→固定→↓结晶紫→初染1分钟→水洗→↓卢戈碘液→媒染1分

6、钟→水洗→↓95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→↓稀释复红→复染1分钟→水洗→↓吸干,镜检。★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。★影响革兰染色的关键是涂片太厚和脱色。革兰阳性菌革兰阴性菌G+链球菌G-双球菌G+杆菌G+短杆菌G-弧菌G-螺菌甲→黄色,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉红。标记：组号，颜色36℃培养4小时4～5×108cfu/ml液体培养基接种BrothTransfer—悬浮法SuspendingMethod细菌在液体培养基的生长情况均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌,大肠杆菌。表面生长形成菌膜

7、：例如枯草杆菌。沉淀生长：例如链球菌。生物安全警告本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。100倍浸油物镜使用方法油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用

8、微调旋钮对好焦距。如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过1～2次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率n=1.515空气折射率n=1.00玻片折射率n=1.52油浸镜的原理光线滴加香柏油可使光线更多进入物镜,避免光线通过折射率低的空气而散失,以提高物镜的分辨率,使物象明亮清晰。放大倍数：目镜10倍×物镜90或100倍显微镜油镜的使用P1310×物镜→标本位置→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）→细调节调焦，观