中华仙影海葵中一类溶细胞多肽cct-i的分离、鉴定及体外性质研究

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1、分类号UDCR932543@编号!Q2窆窆Sl!15Q3lj；工薛大擎硕士学位论文中华仙影海葵中一类溶细胞多肽CCT-I的分离、鉴定及体外性质研究Separation，identificationandinvitropropertystudyofaclassofcytolytictoxinCCT-IfromCereussinensisVerrill指导教师毯朝睡麴授，塞松研究员作者姓名史文呈申请学位级别亟±学科(专业)生药堂论文答辩日期2014．06．1l学位授予单位和日期江菱太堂至Q里垒生§且答辩委员会主席：评阅人：．．懈学位论文版权使用授权书‘本学

2、位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：鼢翠∞啤年‘月f6El指导教师签名：强弼昏≯，悻6月∥日独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或

3、撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：始卑日期：加f侔6月江苏大学硕士学位论文摘要中华仙影海葵CereussinensisVerrill属于绿海葵科仙影海葵属，是我国沿海普遍分布的一种有毒海葵，也是一味常用海洋药物，具有收敛固涩、祛湿杀虫和滋阴壮阳等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、饶虫病和体癣等。中华仙影海葵触手内含有大量的刺丝囊，内含丰富的海葵毒素，主要为神经类和溶细胞类蛋白质或多肽毒素，这些毒素具有多种生物活性，一直以来都是海洋生物毒素研究的重

4、要内容。本文以中华仙影海葵中的溶细胞毒素为研究对象，利用冻融、盐析、柱层析、电泳、HPLC及LC．MS对其进行提取、分离、纯化和鉴定；并进行了这类毒素的体外稳定性、抗肿瘤活性以及对小鼠的急性毒性试验。主要研究内容和结果如下：1、中华仙影海葵溶细胞毒素的分离纯化及鉴定：采用正交试验优化出海葵溶细胞毒素的最适合提取方法，并利用硫酸铵盐析的方法得到初步纯化的海葵毒素，通过SephadexG．100、Superdex75、Source15Q色谱分离、纯化得到一个含有两个多肽的纯度较高的溶细胞活性组分。经SDS．PAGE电泳检测，这两个多肽的分子量均在80kDa

5、左右，分别对这两个多肽进行LC．MS鉴定，结果显示这两个多肽的断裂片段相似，但在NBCI库中却无相似的多肽，故推测其为一类新型的海葵溶细胞毒素，该活性组分命名为CCT-I。2、CCT-I的体外溶细胞活性及影响因素的研究：CCT-I具有很强的溶细胞活性，其浓度大约在5．75lag·mL。时便可以引起半数的2％大鼠红细胞混悬液的破裂。但过高或过低的孵育温度、强碱或强酸条件及随着放置时间的延长，都会导致CCT-I溶细胞活性的降低；此外，不同的金属离子，如Cu2+，M92+，Zn2+和ca+都可以抑制CCT-I的溶细胞活性，但EDTA对CCT-I的活性具有保护

6、作用，其保护作用具浓度依赖性。3、CCT-I的体外抗肿瘤活性的研究：采用MTT法研究了不同浓度的CCT-I对人宫颈癌Hela细胞和肺癌A549细胞的抑制作用，结果显示：CCT-I对这两株肿瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用，对Hela肿瘤细胞和A549肿瘤细胞的半数抑制数分别为14．52lag·mL。和22．18lag·mL～，而且当CCT-I的浓度为50lag·mL。时，其对Hela肿瘤细胞和A549肿瘤细胞的抑制率均超过了70％。4、CCT-I对小鼠的急性毒性研究：采用小鼠尾静脉注射法研究了CCT-I的中华仙影海葵中一类溶细胞多肽CCToI的分离、鉴

7、定及体外性质研究急性毒性，得出CCT-I对小鼠尾静脉注射的半数致死数为173．57肛g／kg，虽然实验致死小鼠各内脏的表观形态与生理盐水对照组的差异并不明显，但组织切片显示实验组小鼠的肺部及肾脏发生病变，所以我们推测CCT-I对小鼠毒性作用的靶器官可能是肺部和肾脏。以上试验结果为中华仙影海葵溶细胞毒素的研究和后续开发提供了较为可靠的科学依据。关键词：中华仙影海葵，溶细胞毒素，分离纯化，体外稳定性，抗肿瘤活性，急性毒性江苏大学硕士学位论文ABSTRACTCereussinensisVerrillisatoxicseaanemoneandwidelydis

8、tributedalongthecoastinChina．Besides，itisakindo