基于液质联用技术的连翘体内外代谢研究

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1、河北医科大学硕士学位论文基于液质联用技术的连翘体内外代谢研究姓名：刘西哲申请学位级别：硕士专业：药物分析学指导教师：张兰桐201203中文摘要基于液质联用技术的连翘体内外代谢研究摘要中国药典(2010年版一部)收载的连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Fors汕ia)植物连翘(Forsythiasuspense(Thunb．)Vahl)的干燥果实。该属植物多丛生于山野荒坡间，各地亦有人工栽培。广泛分布在辽宁、河北、等地。人们对其化学成分进行分析，发现该植物富含木脂素类、黄酮类、苯乙醇类及挥发油类等成分。连翘为中医常用的清热解毒药，近年来，国内

2、外对连翘药理学作用的报道也逐渐增多，主要集中在以下几方面：抗菌作用、抗病毒、抗炎作用、抗内毒素作用、抑制弹性蛋白酶、cAMP磷酸二酯酶活力的作用、保肝、利尿作用、解热作用及镇吐、镇痛作用等。迄今，国内外学者对该植物的化学成分分离与鉴定、体外定量分析研究较为广泛，而对于体内外代谢研究涉及颇少。然而连翘在中药处方中占有很大的比重，研究连翘的体内外代谢途径，探索连翘的药效物质基础就显得格外重要。液相色谱．质谱联用技术(LC．MS)具有专属性高、快速灵敏等优点，是目前化学成分定性和定量分析的有力工具。本研究采用LC．MS技术建立连翘中5种有效成分在大鼠胆

3、汁中的定量分析方法，为阐明其体内代谢途径奠定基础；LC和LC．MS法研究大鼠肠内菌体外转化连翘苷的代谢产物，并用制备液相制备出3种代谢产物，核磁共振技术确定代谢物结构；建立血浆样品中连翘苷及其2种代谢产物的LC。MS定量分析方法，探索其药代动力学参数；建立灌胃给予大鼠连翘苷水溶液后，不同时间点的大鼠胆汁、粪便和尿液中连翘苷及其3种代谢物的定量分析方法，研究其体内排泄规律，进一步了解连翘苷的体内代谢过程及药效物质基础。第一部分LC．ESI．MS。MS法同时测定大鼠胆汁中连翘5种有效成分的含量目的：建立一种专属性好、灵敏快捷的方法同时测定大鼠胆汁中连

4、翘5种有效成分的含量，考察其在大鼠体内的胆汁排泄动力学规律。方法：大鼠按20meCkg灌胃给予连翘水提液后于不同时间点采集胆汁样品，用LC．ESI。MS技术MRM负离子扫描模式定量分析胆汁中连翘5种有中文摘要效成分的经时变化。质谱条件：离子源为电喷雾离子化源(ESI)：采用多反应离子监测(MRM)进行负离子检测：源喷射电压(IS)为．4500V；雾化温度为600℃；雾化气(GSl，N2)：40psi；辅助气(GS2，N2)：50psi；气帘气(N2)：25psi。5种被测成分的监测离子对分别为(+)一pinoresinol—p—D—glucosi

5、de(519．3／357．2)，matairesinol一4’一0一glucoside(519．3／357．2)，hyperin(463．2／300．1)，phillyrin(533．5／371．2)，phillygenin(371．2／356．1)。色谱条件：色谱柱：SapphireC18色谱柱(150mmx4．6mm，5gm，美国)，SapphireC18保护柱；流动相：含O．1％甲酸的甲醇．水，梯度洗脱；流速：O．7mL／min；分析时间：15min；柱温：30。C；进样量：10此。结果：所建立的方法精密度、准确度、检测限和定量限均符合要求

6、，被N5种有效成分在测定范围内线性关系良好。胆汁排泄药动学试验表明，连翘5种有效成分在36h内经胆汁排泄完全，5种有效成分的排泄量都主要集中在10"--"12h。5种有效成分的胆汁累积排泄量分别约占给药量的0．002％，0．234％，0．116％，0．288％和12．700％。结论：本研究建立了LC．ESI．MS．MS法同时测定大鼠胆汁中连翘5种有效成分的含量，可用于连翘中5种有效成分在大鼠体内的排泄动力学研究，该方法简便、快速。专属性好，可用于连翘5种有效成分在大鼠胆汁中的定量分析，该法对连翘药材的体内定量分析具有重要意义。第二部分大鼠肠内菌转

7、化连翘苷的代谢产物研究目的：将连翘苷与大鼠肠内菌于体外厌氧温孵培养，建立LC。MS／MS方法研究肠内菌转化连翘苷的代谢产物。并放大制备转化产率最高的代谢物。方法：将大鼠新鲜粪便和连翘苷于体外厌氧温孵培养，对连翘苷进行体外代谢研究，寻找代谢产物并进行放大制备，得到代谢产物单体，通过1H一№很和MS方法鉴定其代谢产物，确定结构。结果：发现3种代谢产物，用制备液相放大制备，纯化得到3种代谢产物的单体，通过1H-NMR和MS法对其进行结构确证，经鉴定，代谢产物分别2一[(3’，4’一二羟基)苯基]．6一【(3¨，4¨．二羟基)苯基】骈双四氢呋喃(M1)、

8、2一[(3’，4’一二羟基)苯基]．6一【(3”，4”一二甲氧基)苯基]骈双四氢呋喃(M2)、2一[(3’，4’一二羟基)苯基】03一羟