生物样品中c60含量的荧光分析研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyonC60inbiologicalsamplesbyFluorescenceSpectrophotometryByMinSunSupervisor：Dro．HanchunYaoPharmaceuticalanalysisSchoolofpharmaceuticMay2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容

2、外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位

3、论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日摘要摘要1985年Kroto等人在研究激光蒸发石墨的过程中发现了C60，由于其独特的结构而具有特殊的理化性质。目前，C60及其衍生物已广泛用于抑制蛋白和酶的活性、切割DNA和光动力学治疗、清除自由基和作为靶向制剂的载体等，在生物和医学领域展现出巨大的潜力。然而，对于C60进入生物体内行为的研究还为数不多，而且C60多数是以纳米颗粒存在于分散液中，进入

4、体内后会在不同的组织器官中发生沉积，对生物体产生一定的毒害损伤。因此需要系统研究C60在生物体内的分布、代谢以及定量情况，而对生物样品中C60的含量测定是研究其在体内行为的一个重要方面，本论文从以下几个部分来研究C60的含量测定及与蛋白相互作用。1、肝癌细胞内C60含量测定实验采用安全浓度范围内的泊洛沙姆(10％polo)分散C60，得到稳定的C60分散液。对C60分散液荧光性质进行考察，得到最佳的激发和发射波长分别在220illn和371nlil处。实验中培养肝癌细胞的培养液中含有胎牛血清，而胎牛血清在波

5、长300．500nnl处有荧光发射，对C60分散液的含量测定产生干扰。另外，消化细胞时所用的胰酶主要由胰蛋白酶、胰淀粉酶与胰脂肪酶组成，同样在C60分散液的荧光测定范围内有荧光发射，影响测定。因此需要对样品进行处理以排除这些干扰。实验通过以PBS代替培养基吹打细胞，多次离心去除胰酶的干扰；采用碳超破碎细胞后离心，去除细胞内源物质的干扰，使得该荧光光谱法得到较好的测定结果。实验结果表明，C60在1．2846．03mg／L浓度范围内线性关系良好，肝癌细胞裂解液中C60平均回收率为86．5％，RSD为10．8％。

6、2、C60与牛血清白蛋白相互作用研究实验中发现，使用文献报道过的方法处理血样后，空白血样在荧光分光光度计上扫描得到的荧光强度高于含C60的血样的荧光强度，使用阳离子表面活性剂CTAB处理血样也出现了同样的情况。因此以牛血清白蛋白为模型，通过实验进一步计算C60与牛血清白蛋白的淬灭及结合常数可以得出C60与牛血清白蛋白之间产生了一定的相互作用，并且影响了牛血清白蛋白的结构。初步推测是由于牛血清白蛋白构象的改变致使其水溶性降低，在离心的过程中将C60一同离心到沉淀中，而使上层清液中存在的C60含量减少从而导致荧

7、光分光光度计无法摘要检测出C60的信号。实验结果表明，C60水溶液对牛血清白蛋白有荧光淬灭作用，两者结合常数在104L／mol数量级以上，结合位点接近于色氨酸残基。根据热力学参数推断C60水溶液与牛血清白蛋白有可能是通过疏水作用力相互结合。实验中采用溶剂置换(甲苯与水)的方法制备C60水溶液，加入表面活性剂对C60的分散及荧光强度没有明显的增强效果。同时考察了C60水溶液的浓度确定方法，使用NaCI破坏C60水溶液稳定性，甲苯提取率达到98％以上，可以认为此方法能够提取完全。3、血清中C60含量测定曾有文献

8、报道采用HPLC法测定血样中C60的含量，测定的准确度较高，但是由于血样处理过程较为复杂而且使用甲苯作为流动相，对操作者和仪器均有较大损害，同时样品损失较大，测定结果不能真实反映体内C60含量。本实验采用荧光分光光度法，血样离心得到的血清不经过任何处理，利用二阶导数荧光法排除血清中其他物质的干扰而对C60进行含量测定。实验结果表明，C60水溶液在0．14—1．37mg／L范围内线性关系良好，检测限为19．0t．t