a型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究

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1、万方数据万方数据iiiiiiiiiiiiii萱iiiiiiiiiiiii宣iiiiiiiiiiiiii宣i萱iiiiiiiiii宣iii--miiiiiiiiiii㈣瞅A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究摘要单链抗体(single-chainantibodyfragment，ScFv)是基因工程方法制各的小分子抗体，由弹性连接肽将抗体的重链可变区与轻链可变区连接而成的重组抗体。其不含有抗体分子的恒定区片段，因而免疫原性弱，使抗体的作用更集中于靶细胞部位，实体组织穿透力强，血浆半衰期短等，在临床诊断及治疗中具有重要的应用价值。

2、本研究选择猪流感病毒A／Swine／Guangdong／2004(H1N1)和禽流感病毒A／Goose／Guang，dong／1／96(H5NI)毒株分别作为抗H1亚型和H5亚型单抗制备的免疫原，将其lIA基因克隆到真核表●_●达载体pVAXI中构建了重组质粒pVAXI-HAI和pVAXI-HA5。使用纯化的pVAXI-HAI、pVAXl-HA5和全病毒灭活抗原H1N1、H5N1分别免疫5周龄Balb／c小鼠，通过纯化的病毒GD／04(HlNl)和GD／l／96(H5NI)作为ELISA反应的包被抗原，筛选出阳性克隆。经过四轮亚克隆，

3、共获得12株抗HINI流感病毒的单抗和23株抗H5NI流感病毒的单抗。然后，对ELISA实验为阳性的样本再进行中和实验筛选，最终得到4株ELISA反应为强阳性，并且具有中和活性的抗H1N1的细胞克隆，分别命名为8HI、4D5、5C6和5c3；4株抗H5NI的细胞克隆，分别命名为3F2、7H5、3D6和3F9。分别提取8株单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA后，使用兼并性引物克隆得到单克隆抗体的轻、重链基因，并进行测序。通过在NCBI数据库进行序列分析比对确定后，应用SOE—PCR方法，将轻链和重链基因通过一条连接肽连

4、接，得到完整的单链抗体基因。将ScFv基因插入到pCDNA-3．1载体中，构建了pCDNA-ScFv真核表达系统。j+“一?’将pCDNA-ScFv转染MDCK细胞，用病毒滴定、荧光定量PCR、高内涵成像系统研究了抗流感病毒复制的活性。结果表明：单链抗体8HI和4D5可以明显的抑制HINI流感病毒的复制，并能抑制病毒传播。单链抗体5C6和5C3可以轻微的抑制HINI流感病毒的复制。单链抗体3F9可以明显的抑制H5NI流感病毒的复制，并能减少病毒的释放和传播。单链抗体3F2和3D6可以轻微的抑制H5N1流感病毒的复制，Trl5没有作用。

5、本研究不仅为流感病毒感染的抗病毒治疗性研究提供了实验支持，并为流感病毒的防治提供了新的技术手段。关键词：流感病毒：单克隆抗体；单链抗体Ⅱ万方数据Cloningandanti．viralactivityof、ScFvsAgainstInfluenzaAVirusAbstractSingle-chainantibodyfragment(ScFv1iSsmallmoleculeantibodythatpreparedbygeneticengineeringmethods．Therecombinantantibodyretainsheavyc

6、hainvariableregionandlightchainvariableregionofwholeIgGmoleculesconnectedbyaelasticconnectingpeptide．Itdoesnotcontainfragmentsoftheconstantregionoftheantibodymolecule，andhasbeenshowntohavereducedimmunogenicitythatmakeantibodiesmorefocusedontheroleoftargeteellsite．Itimpr

7、ovedpenetrmionintoasolidtumorandhaveashorterhalfIifeiIlplasma．ScFVhasimportantapplicationsinclinicaldiagnosisandtreatment．+A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)andA／Swine／Guangdong／2004(H1N1)waschosenastheHAgenedonor．TheHAgeneswereclonedintopVA-X1vectortoconstructrecombinantplas

8、midP、Cf气X1．HAlandP、17：fⅨ1一HA5．thatwasusedasDNAvaccines．BALB／cmicewereimmunizedwithPVAXl．HAl、pVAXI．HA5andinacti