金属硫蛋白抗阿霉素心脏毒性的线粒体机制研究

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1、河南大学硕士学位论文金属硫蛋白抗阿霉素心脏毒性的线粒体机制研究姓名：雷蕾申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：彭双清201206摘要阿霉素，也称为阿霉素(Doxorubicin,DOX)，是临床上最常用的广谱，高效的抗癌药物。阿霉素具有显著的心脏副作用，严重限制了其临床应用。阿霉素在体内代谢过程中产生的大量活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies，ROS)，心肌细胞产生过剩的活性氧攻击可能是导致阿霉素导致的心脏氧化损伤的主要原因。线粒体是细胞能量的主要来源，心肌细胞是一个高耗能细胞，线粒体丰富。与其他肌细胞相比，心肌细胞需要更多的ATP供应，用以维持其旺盛的

2、新陈代谢和生命活动。因此，心肌细胞对外源化学物质导致的线粒体损伤和功能障碍是非常敏感的。心肌线粒体是阿霉素毒性作用的一个主要靶标，心肌线粒体损伤是阿霉素心脏毒性的重要特征。金属硫蛋I刍(Metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸的低分子量非酶蛋白，广泛存在于哺乳动物的各种器官组织中。初步的研究证实，MT有阿霉素的心脏毒性的保护作用，但其作用机制仍不清楚。高MT表达可以抑制阿霉素诱导的线粒体形态变化和细胞色素C的释放，降低细胞内ROS水平，从而抑制caspase．3的活化，减少心肌细胞凋亡的心肌损伤模型，MT高表达也减少线粒体形态的变化，抑制线粒体细胞色素C的释放

3、和ROS生成提示线粒体可能是MT的抗阿霉素的心脏毒性的主要目标，其作用机制有待进一步研究。本研究利用C57BL野生型小鼠及同源的MT基因(I／II)敲除小鼠研究DOX的心肌线粒体毒性效应，通过急性和慢性两种给药方法，着重从线粒体功能紊乱和氧化损伤方面探讨线粒体在MT抗DOX心脏毒性中的地位并探讨其可能的作用机制。1．线粒体在MT抗DOX心脏毒性中的关键地位采用野生型小鼠(MT+／+)诱导MT高表达建立MT高表达模型，结合MT缺失模型(MT-／．)，观察MT不同表达水平对DOX致心肌线粒体毒性损伤的特点，探讨MT抗DOX心脏毒性的可能机制。MT十／+小鼠及MT-／．小鼠分别随机

4、分成4组，即给药5次组(5×DOX)、给药lO次组(10xDOX)、5次对照组(5XNS)、10次对照组(IO×NS)。动物单次腹腔注射DOX(2mg／kg)或等剂量的生理盐水(NS)，每周给药两次，共给药lO次，5次组给予五次DOX或NS后停止给药。给药结束后经过两周清除期，光学显微镜及透射电子显微镜观察心脏组织形态学及线粒体超微结构的改变；测定心脏组织匀浆中MT水平；提取心肌线粒体，检测线粒体中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，观察心肌线粒体脂质过氧化程度；测定抗氧化物谷胱甘肽过氧化酶(GSHpx)和过氧化氢酶(CAT)的活性。结果表明，慢性给药处理5次后，病理观察只有

5、DOX组的MT-／-小鼠出现心肌细胞形态学损伤，DOX组的MT十／+小鼠和对照组均无明显损伤；电镜观察发现DOX组的MT+／+和MT．／-小鼠均出现线粒体损伤，MⅣ小鼠心肌线粒体损伤程度大于MT十／+小鼠；DOX组较对照组线粒体MDA含量有所增加，GSHpx活性下降，MT-／-小鼠比MT十，+小鼠的变化更为明显；给药lO次后病理观察DOX组MT．／．小鼠心肌细胞形态学损伤程度更为严重，DOX组Mn．／+小鼠心肌细胞也出现损伤现象；较之给药5次的小鼠，电镜观察给药10次后小鼠DOX组的线粒体出现更显著的线粒体损伤，且线粒体内MDA含量升高和GSHpx活性下降的程度增加。提示线粒

6、体是阿霉素诱导氧化损伤的敏感部位。2．心肌线粒体毒性损伤特点及金属硫蛋白的保护作用Mn．／+小鼠和MT-／-小鼠随机分别分成2组，即对照组和给药组。给药组动物单次腹腔注射DOX(15mg／kg)，对照组注射等剂量的NS。给药后第4天处死动物，迅速摘取心脏。用TTC染色法鉴定DOX对小鼠心肌的损伤；差速离心法提取心肌线粒体，测定线粒体中脂质过氧化产物MDA及蛋白羰基化产物含量以观察心肌组织脂质过氧化和蛋白氧化损伤程度；测定抗氧化物还原型谷胱甘肽(GSI-I)含量以及抗氧化物谷胱甘肽过氧化酶(GSHpx)活性；Westernblot法检测心肌线粒体抗氧化防御酶锰超氧化物岐化酶Mn

7、SOD和细胞凋亡相关信号因子Caspase-3的蛋白表达。结果表明，急性给药处理后，DOX组出现明显的线粒体氧化损伤，心肌线粒体中MDA和蛋白羰基化产物含量增加；线粒体抗氧化物GSH含量下降，GSHpx活性降低；MnSOD表达减弱，细胞凋亡因子Caspase．3的表达增强，而MT．／-小鼠线粒体损伤程度比Mn-／+小鼠更为严重。以上实验结果表明，MT对DOX心脏毒性具有明显的保护作用，而线粒体是MT产生抗DOX心肌毒性的主要作用靶点。关键词：金属硫蛋白，阿霉素，心脏毒性，线粒体，氧自由基，抗氧化物ⅡAB