孕酮对aβ25-35诱导的ad样损伤神经元氨基酸类递质系统的影响和机制初探

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1、河北医科大学硕士学位论文孕酮对Aβ25--35诱导的AD样损伤神经元氨基酸类递质系统的影响和机制初探姓名：魏计超申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：侯艳宁201203中文摘要孕酮对A132”5诱导的AD样损伤神经元氨基酸类递质系统的影响和机制初探摘要目的：阿尔采末病(Alzheimer’sdisease，AD，又名阿尔茨海默病，早老性痴呆)是一类以进行性记忆力损伤和认知障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变，是老年痴呆最常见的一种形式。目前的研究认为，脑内p．淀粉样蛋白(p-amyloid

2、，Ap)沉积形成的老年斑可能是AD致病的核心机制。近年的实验研究表明，神经甾体对包括AD在内的神经退行性疾病的治疗具有重要意义。本实验室前期研究发现，神经甾体孕酮‘(progesterone，PROG)和脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)可通过调节氨基酸类递质系统，降低神经系统的兴奋性，从而起到神经保护的作用；并且PROG能够浓度依赖的抑制Ap诱导的神经毒性作用，提高神经元存活率。提示，PROG可能通过调节氨基酸类递质系统的兴奋性来对抗AB诱导的神经毒性作用，从而

3、改善AD的症状。本研究将SD大鼠的大脑皮质神经元进行体外原代培养，采用Ap活性片断Ap25．35体外诱导神经元损伤，用神经甾体PROG处理，采用高效液相色谱．串联质谱(HPLC．MS／MS)法检测细胞培养液中谷氨酸(GLU)和哥氨基丁酸(GABA)的浓度；采用免疫细胞化学法测定神经元氨基酸受体亚单位NMDAR2B(NR2B)和GABAR2(GBI迎)受体的表达，以观察PROG对AD样损伤神经元中氨基酸类神经递质释放及其受体表达的影响，进一步探讨PROG对抗hi3所致神经元损伤的机制，从而为预防和治

4、疗AD提供新的思路。方法：1大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及形态观察取新生SD大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化并辅以机械分离法分离细胞，将其悬浮于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，活细胞密度调整为1．O×109L～，培养板中预先放入包被L．多聚赖氨酸的圆形玻璃盖玻片并接种细胞，在370(2，5％C02及饱和湿度的细胞培养箱中孵育，24h后首次换液为neurobasal完全培养基，以后每隔两天半量换液。取培中文摘要养第10天的神经元供实验用。倒置显微镜下观察神经元的形态学变化。2分组和

5、药物处理方案2．1建立Ap25-35致AD样神经元损伤模型取培养第10天的神经元，随机分为空白对照组(contr01)、GLU处理组(GLU浓度为1mmol·L以)及低、中、高3个浓度Ap2”5处理组(A[3L、ApM及ApH，终浓度分别为O．1praol·L-1、1哪01．L以及10lJxn01．L．1)，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，进行神经元形态学观察和MTT测定。2．2PROG处理对hi325-35诱导的AD样神经元损伤的影响取培养第10天的神经元，随机分为空白对照组(con

6、tr01)、模型组(model)、及低、中、高3个浓度PROG处理模型组(PL、PM和PH，终浓度分别为0．001岬ol·L～、0．01¨rnol·L。和O．1I．tmol·L～，各组同时加入模型组浓度的Ap25-35)，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，进行神经元形态学观察和MTT测定。2．3GLU、GABA浓度测定和NR2B、GBR2受体亚单位表达测定实验分组同“2．2”，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，取细胞培养液用HPLC．MS／MS法测定GLU、GABA浓度；取附着

7、在盖玻片上的神经元用免疫细胞化学法测定NR2B、GBR2受体亚单位表达。3MTr法检测细胞存活率将细胞接种于24孔板，培养第lO天，加药处理完后，每孔加入80止MTT液(3．6mmol·L。)，37℃继续孵育4h，弃上清，加入300止DMSO溶解甲瓒结晶，以空白孔调零，用紫外分光光度计测定570nnl波长处的吸光度值，设空白对照组吸光度的均值为100％，以各样本吸光度值／空白对照组吸光度的均值为该样本的细胞存活率。4HPLC．MS／MS法测定细胞培养液中GLU和GABA的浓度取细胞培养液lml置l

8、Oml离心管中，加入3m1甲醇涡旋震荡3min，离心(3000r．min-1,10min)，取上清液40"C水浴氮气流下吹干，残渣用100此浓度为50ng·ml。的内标液吗啡(morphine，MOR)溶液溶解，进样5止。用于HPLC．MS／MS分析的色谱条件：色谱柱为ZIC．HILIC柱(2．1minx50111111，3．5岬，德国默克时光公司)；保护柱为C18柱(4mmx2．0n吼，美国Phenomenex公司)；流动相为乙腈：水=8：2(v～，含O．5％甲酸)；中文摘要流速