erk蛋白磷酸化在体外培养星形胶质细胞缺氧复氧后活化及增殖中的作用

《erk蛋白磷酸化在体外培养星形胶质细胞缺氧复氧后活化及增殖中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、徐州医学院硕士学位论文ERK蛋白磷酸化在体外培养星形胶质细胞缺氧/复氧后活化及增殖中的作用姓名：窦长新申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：董瑞国2012-04徐州医学院硕士学位论文ERK蛋白磷酸化在体外培养星形胶质细胞缺氧／复氧后活化及增殖中的作用中文摘要目的本课题通过研究体外培养星形胶质细胞(astrocyte，AC)缺氧／复氧后增殖、凋亡及阻滞ERK蛋白磷酸化后增殖和凋亡的变化，从而探讨ERK蛋白磷酸化在AC缺氧／复氧后反应性增殖中的作用，为临床上调控脑卒中后AC反应性增殖，预防AC增殖失

2、控所致胶质瘢痕的形成提供理论支持。方法取新生24h内SD(SpragueDawley)大鼠大脑皮层组织，参照McCarthy等的方法进行AC原代培养，经差速贴壁法提纯后，置于细胞培养箱内培养。7～8天后，细胞融合明显，采用摇床震荡法提纯细胞后，进行细胞传代培养，传至第4代时，细胞自然纯化，采用神经胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)免疫荧光鉴定AC，阳性率97％以上时符合实验要求。采用特异性ERK磷酸化阻滞剂U0126为阻滞剂，终浓度为101amol

3、／L，均在缺氧前30min加入，无阻滞剂组加入等量培养基。将纯化鉴定后的AC分为正常对照组(C组)、正常阻滞剂组(C+M组)、缺氧／复氧组(14／1之组)、缺氧／复氧阻滞剂组(H／R+M组)。用三气培养箱给予95％N2、5％C02造成细胞缺氧，建立AC缺氧／复氧模型。选取正常组及缺氧8h然后复氧0h，4h，8h(分别标记为H8，H8R4，H8R8)的细胞应用Western—blot(免疫印记)检测ERK蛋白磷酸化水平及UOl26对其磷酸化的影响。选取正常组及缺氧8h然后复氧oh，8h，12h，24h

4、，48h(分别标记为H8，H8R8，H8R12，H8R24，H8R48)的细胞，分别应用MTT法分别测定细胞活力、5．溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo．2．deoxyUridine，Brdu)及GFAP双染色观察细胞的增殖情况、ELISA(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)法测定肿瘤坏死因子．。【(TumorNecrosisFactor．0【，TNF．0【)的分泌情况。选取正常组及缺氧8h然后复氧Oh，8h，12h，24h徐州医学院硕士学位论文(分别标记为H8，H8R8，

5、HSRl2，H8R24)的细胞，采用AnnexinV／碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)双染法应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。采用SPSS16．0统汁软件包进行数据分析。结果1GFAP鉴定结果：GFAP+DAPI(4’，6-diamidino．2．phenylindole)免疫荧光双标显示双阳性细胞的胞质为绿色，细胞核为蓝色，结果显示98％以上为阳性细胞，符合实验要求。2．Western．blot半定量检测：非缺氧组ERK蛋白磷酸化水平较低，缺氧组细胞缺氧／复氧后各时间点ERK蛋白磷酸化

6、水平较非缺氧组升高(尸<0．05)。阻滞剂组ERK蛋白磷酸化水平较无阻滞剂组下降。3．MTT法检测细胞活力：缺氧组细胞随时间延长，AC活力较非缺氧组降低的趋势更加明显，复氧12h后差异有统计学意义(P<0．01)；阻滞剂组较无阻滞剂组细胞活力下降，复氧12h后差异有统计学意义(P<0．05)。4．Brdu免疫荧光检测AC增殖：非缺氧组细胞未见染色，缺氧组细胞缺氧期未见染色，复氧后随时间延长细胞核染色逐渐增多(P<0．05)。阻滞剂组细胞复氧后各时间点较无阻滞剂组细胞核染色减少，随时间延长，组间差异逐

7、渐显著，复氧48h时差异有统计学意义(P<0．01)。5．ELISA法检测TNF．cc分泌：非缺氧组给予阻滞剂后较非缺氧无阻滞剂组比较差异不明显，缺氧组各时间点TNF．0【的分泌较非缺氧组升高(P

8、5)，随时间延长，升高趋势逐渐明显，给予U0126后细胞的凋亡率升高更加显著，在复氧24h时差异有统计学意义(P<0．01)。结论1．ERK蛋白磷酸化水平升高促进星形胶质细胞缺氧／复氧后反应性增殖。2．ERIC蛋白的磷酸化促进星形胶质细胞缺氧／复氧后反应性增殖可能与其改善星形胶质细胞缺氧／复氧后细胞活力，抑制其凋亡发生及减轻炎症活化程度有关。关键词：缺氧／复氧；星形胶质细胞：增殖；凋亡；ERIC；p-ERK徐州医学院硕士学位论文ThelevelsofERKphosph