rg108对水牛成纤维细胞甲基化水平及核移植胚胎发育的影响

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1、广西大学硕士学位论文RG108对水牛成纤维细胞甲基化水平及核移植胚胎发育的影响姓名：蒙丽娜申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：陆凤花；石德顺20120529RGlaS对水牛成纤维细胞甲基化水平及其核移植胚胎发育的影响摘要体细胞核移植技术在多年的研究发展中日益完善，但核移植效率仍然较低，限制了体细胞核移植技术的应用。目前普遍认为，核移植效率低主要是由于供体细胞核在卵母细胞中的去分化和重编程不完全。体细胞核移植重构胚常常表现为DNA甲基化水平过高。本研究拟通过探讨新型DNA甲基转移酶抑制剂RGl08对水牛成纤维细胞甲基化水平及其核移植重构胚发育的影响，探索一种能提高核移植效率

2、的有效途径。首先，探讨了不同浓度DNA甲基转移酶抑制剂RGl08对水牛成纤维细胞生长特性、染色体倍性、DNA甲基化水平及DNMTsmRNA表达量的影响。第7代水牛成纤维细胞经不同浓度RGl08(0，5，10，20，100lamol／L)处理72h后，分别对细胞的生长状态、染色体倍性及甲基化水平等进行检测分析。结果显示：(1)经台盼蓝染色结合细胞计数法检测细胞存活率并绘制细胞生长曲线，发现经不同浓度RGl08处理的水牛成纤维细胞生长曲线与对照组(olmaol／L)基本一致，各组间细胞的存活率没有显著下降现象(P>O．05)；(2)细胞常规染色体核型分析发现，不同浓度组(0、5、10、20、

3、100lⅡnol／L)的细胞染色体非整二倍体百分比(10．3％、12．3％、10．3％、12．1％、12．6％)之间差异均不显著(P>0．05)；(3)免疫荧光组化间接检测水牛成纤维细胞5一甲基胞嘧啶的相对含量发现，随着RGl08处理浓度的升高，水牛成纤维细胞的荧光相对强度逐渐降低，其中添加20、100pmol／LRGl08的两个处理组与对照组差异显著(PO．05)；(4)实时荧光定量PCR(Q．PCR)检测结果显示，浓度为lO、20、100lamol／L的RGl08都显著下调细胞DNMTlmRNA的表达(P<0．

4、05)，并以20tunol／L组最显著，但RGl08对DNMT3amRNA的表达没有显著性影响(P>O．05)。同时，探讨了RGl08处理水牛成纤维供体细胞对水牛体细胞核移植重构胚发育的影响。使用20I．tmol／LRG108分别处理水牛成纤维供体细胞不同时间(0、24、48、72、96h)后进行体细胞核移植。结果发现，20lamol／LRGl08处理供体细胞72h可显著提高核移植重构胚的囊胚发育率(PO．05)。以上结果表明：(1)适宜浓度(≤100mnol／L)的RGl08对水牛成纤维细胞的生长特性、存活率及核型没有

5、显著影响；(2)浓度为20gmol／LRGl08处理水牛成纤维细胞72h，可显著降低其DNA甲基化水平和DNMTlmRNA的表达，从而提高其核移植重构胚的发育能力，增加重构胚的囊胚细胞数。关键词：RGl08水牛成纤维细胞细胞生长曲线细胞存活率染色体倍性DNA甲基化体细胞核移植EFFECTSoFRG108ONTHEDNAMETHYLATIoNLEVELOFBUFFALoFIBRoBLASTSANDDEVELoPMENToFEMBRYoSRECoNSTRUCTEDWITHTHEMABSTRACTSomaticcellnucleartransfer(SCNT)technologyhasbeen

6、improvedsteadilyinrecentyears，buttheefficiencyofnucleartransferisstilllow,whichlimitstheapplicationofSCNTtechnology．Itiswellknownthattheincompletededifferentiationandreprogrammingofdonornucleiintheoocytes-cytoplasmisthemainfactorsleadingtolowefficiencyinnucleartransfer．SCNTembryosoftenshowshighle

7、velsofDNAmethylation．Inthisstudy,theeffectsofRG108ontheDNAmethylationlevelsofbuffalofibroblastsandthedevelopmentofSCNTembryoswereinvestigated，SOthattoexploreaneffectivewayforimprovingnucleartransferefficiency．Firstly，t