10-dab分析方法验证方案

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1、10■去乙酰基巴卡亭III生产和过程控制及成品中含量测定和杂质测定方法（HPLC）的验证方案前言：在红豆杉枝叶及其提取物中存在包括10■去乙酰基巴卡亭111（以下简称10-DAB）在内的大量紫杉烷类化合物，它们种类繁多，性质（特指色谱分离情况）各异，有些物质的性质极为接近，有些物质的性质又相差甚远，尤其对10-DAB而言，其在HPLC中往往出峰较早，在含量分析时除要保证1（）・DAB本身不受相近物质干扰外，还必须考虑与其性质相差很大、色谱上相距很远的相关物质的分析测定。经过前期的摸索，我们确定了方法的基本条件，可同时运用于从红豆杉

2、枝叶、10-DAB起始原料、10・DAB生产过程控制到10・DAB成品中的10-DAB含量测定，也适用于其中杂质的测定。根据样品中10-DAB的含量，将样品分为两类，并采用不同方式计算：a.10-DAB成品：10-DAB的含量＞95%.10-DAB含量测定采用单级标准的外标法；杂质和相关物质的测定采用面积归一化法。b.生产和过程控制样品：包括红豆杉枝叶、10-DAB起始原料、中间体等，10-DAB的含量＜98%。10-DAB含量测定采用多级标准的外标法；杂质和相关物质同法测定，计算时引入相应因子。以下将根据要求对方法进行验证。一、

3、验证目的：通过方法的专属性、线性与范围、准确度与回收率、精密度、定量限、耐用性的验证，证明样品中的10-DAB和杂质按方法测定，能够被有效检出，且准确度、精密度、专属性、线性等均符合要求，从而确认该方法可用于10-DAB生产和过程控制及成品的含量测定和杂质测定。二、仪器及分析条件、参数:1、分析条件、参数：HPLC条件参数仪器HPLC,四元泵或二元泵、配DAD或VWD检测器分析柱ZORBAXSB-CN（规格：250x4.6mm,5um）溶剂色谱级甲醇检测波长227nm柱温20°C流动相三元泵（水、甲醇、乙睛）或二元梯度洗脱进样量1

4、0ul流速1ml/min运行时间70min2、方法测定要求：2.1对10-DAB低含量样品（＜98%）,其10-DAB含量以建立的多级标准曲线测定和计算，样品溶液中的10-DAB浓度要求控制在标准曲线范围内；2.2对10-DAB高含量样品（＞95%）,其10-DAB含量以前后标准为依据测定和计算，样品和标准溶液的10-DAB浓度均为约l.Omg/ml;2.310-DAB高含量样品中相关物质以1.0mg/ml样品溶液测定，按面积归一化法计算。三、仪器、试剂、样品：1、仪器：1.1液相色谱系统：两台，一台为四元泵，用于验证三元梯度流动

5、相；一台为二元泵，用于中间精密度和二元梯度流动相验证。1.2色谱柱：两支不同批号的色谱柱。1.3百万分之一天平。2、试剂：2.1甲醇（色谱级）；2.2乙睛(色谱级);2.3纯水：电导率＜O.lus/cm;2.4乙酸(分析纯)。3、对照品：标示明确纯度的标准品：3.1标准品：3.1.17-木糖基紫杉醇(7-Xylosyipaclitaxel);3.1.210-去乙酰・7-木糖基紫杉醇(lO-Deacetyl-7-xylosylpaclitaxel);3.1.3巴卡亭III(Baccatinlll)o3.1.410-去乙酰基巴卡亭II

6、I(10-DeacetylbaccatinIII);3.1.510■去乙酰基紫杉醇(10-Deacetylpaclitaxel);3.1.6紫杉醇(Paclitaxel);3.1.7三尖杉宁碱(Cephalomannine);3.1.810-去乙酰-7-差向紫杉醇(lO-Deacetyl-7-epipaclitaxel);3.1.97■差向紫杉醇(7-Epipaclitaxel)。四、方法验证：1＞各相关物质相对响应因子(f)的测定：1.1程序：1.1.1测定：分别配制浓度为1.5mg/mR1.0mg/mL0.5mg/mk0.2m

7、g/mRO.lmg/mhO.Olmg/m1和().()()()5mg/ml的(1()・DAB+紫杉醇+三尖杉宁碱+10■去乙酰7差向紫杉醇+7■差向紫杉醇+巴卡亭III+1■務基巴卡亭1+7■木糖基紫杉醇+10■去乙酰基紫杉醇)混合标准溶液，每个浓度进样3次，记录10-DAB及各相关物质峰的保留时间RTi和峰面积久。1.1.2计算：按下式计算各物质相对于10-DAB的相对保留时间RRTi和相对响应因子fioRTj相对保留时间RRTj=(保留至小数点后三位)RT10-DAB相对响应因子fj=XA]O・DAB（保留至小数点后三位）J】

8、O・DABCq1.2当统计数据符合下述标准，取所有测定的平均值（保留至小数点后两位）,作为该相关物质的最终的相对保留时间和相对响应因子。1.3验证标准：1.3.1相对保留时间RRTi白勺RSD%<5%;1.3.2相对响应因子£的RSD%<5%o注：