吗啡对pc12细胞嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响

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1、毗科学发展观促进科技创新(上)吗啡对PCI2细胞嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响刘剑凯吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，130021摘要研究吗啡对神经细胞模型PCI2嘌呤核苷酸补救合成酶与分解代谢关键酶基因表达的影响。应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测PCI2细胞暴露于吗啡不同时间，次黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移醇(HGPRT)，腺苷激酶(AK)，腺苷脱氨酶(ADA)mRNA的表达水平。结果表明吗啡影响神经细胞嘌呤核苷酸代谢，可能导致细胞内腺苷酸及腺苷水平增高，这可能是吗啡依赖和耐受形成的机理之一。本结果为吗啡作用机制的研究提供了新的研

2、究理论和方向。关键词医学生物化学吗啡依赖PCI2细胞核苷酸代谢阿片类药物的耐受和成瘾性一直是影响其药效的关键问题，而药物的依赖和滥用是当今社会一大难题。吗啡的耐受和成瘾作用主要由p受体介导。吗啡抑制脑细胞DNA和RNA合成的作用机制还不清楚，是否通过调控脑核苷酸代谢的一个酶基因或某些酶的基因表达，影响脑核苷酸及核酸代谢；其与耐受和依赖作用有什么关系?相关研究在国内外报道很少。脑组织缺乏从头合成嘌呤核苷酸的酶体系，只能进行补救合成嘌呤核苷酸，次黄嘌呤腺嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)和腺苷激酶(AK)是补救合成途径的关键酶，前者催化次黄嘌呤和鸟嘌呤直接合成次

3、黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)，后者催化体内的腺嘌呤核苷的重新利用，使腺苷生成腺嘌呤核苷酸(AMP)。腺苷脱氨酶(ADA)是嘌呤核苷酸分解代谢的关键酶，在体内其有广泛的分布，其作用是催化腺嘌呤核苷水解脱氨，再经若干反应生成终产物尿酸。本实验室曾在细胞水平上对大鼠神经胶质瘤细胞‘进行吗啡作用的研究。PCI2细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，常作为研究神经细胞的细胞模型。因此我们研究PCI2细胞不同时间内暴露于吗啡。是否通过对嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的变化。影响大鼠神经细胞嘌呤核苷酸的代谢。进一步为吗啡依赖作用机制提供新的研究方向。一、材料与方法

4、(一)药品和试剂PCI2细胞购于上海细胞研究所。DMEM培养基购于GibcoBRL公司。新生牛血清为国产，马血清为Hyclone公司产品。盐酸吗啡，沈阳第一制药厂生产。生理盐水由本实验室配置。逆转录酶，Tr．izol试剂购自Gibco／BRL公司；其他试剂为国产分析纯。lkbDNAMarker购于Gibco／BRL公司。(二)细胞培养PCI2细胞置于DMEM培养液中，内含5％胎牛血清，5％马血清，青霉索100U／mL，链霉素100pg／mL。置于37"C5％coz孵箱中培养传代，每次传代均以259／L胰蛋白酶消化，洗涤1次，更换新培养以科学发展观促进科技创

5、新(三)561基。实验用细胞接种浓度为5×105g／L。次日用吗啡或生理盐水处理细胞(10越／mLl。(三)实验分组和药物处理①③⑤⑦为生理盐水对照组，分gU于培养12h、24h、48h、72h后收集细胞。②④⑥⑧为吗啡处理组，分别单独给予吗啡(10“g／mL)处理12h、24h、48h、72h后收集细胞，将离心收获的细胞沉淀溶于Tr—izol试剂充分吹打，总RNA按试剂说明提取。(四)逆转录与聚合酶链反应1．引物特异性引物由宝泰克公司合成，其中ADA引物为应用Oligo软件自行设计。顺序如下：ADA上游引物：5’一CAAACGcAAAGTGGGAGGTC

6、一37，下游引物：5’一TTTGCCATCGAG—GTCTCTGTC一3’，扩增产物长度为288bp。HGPRT上游引物：5’一GCTGACCTGCTGGAlvrACAlvrA一37下游引物：5’一cCACTTTCGCT．GATGACACAA一3’，扩增产物长度为410bp。AK：上游引物：5’一GATGATrcAGGAGCCACAGAGCAG一3’，下游引物：5。一AGTGACAT．CATTTcCTGTAGCcAc一3’，扩增产物长度为616bp。8一actin上游引物：57一GAAATCGTGCGTGACATTAAG一3’，下游引物：5’一CTAGAA

7、GCATTT．GCGGTGCA一37，扩增产物长度为515bp。2．RT反应1肚RNA样品，加入lpLOligodT80'C变性lOmin，变性后冰水浴5min。依次加入5X逆转录酶缓冲液．2弘LdNTP(10mM)，0．5,uLRnasin，MMLV逆转录酶lOOu，用水补足至20”L于PCT仪上420C反应60min，然后95℃5min灭活逆转录酶，一20℃保存备用。3．PCR反应在0．2mLEP管中建立以下的反应体系：10XPCRbuffer2．5FL，dNTP，2HL(10mM)特异性上游及下游引物各25pmol及内参引物p—actin上游及下游引

8、物各25pmol，补足水至24“L，最后加1止T8qDNA聚合酶(