“肾主生殖”与颌下腺—睾丸轴的关系

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1、自然恢复后拆线。2．2给药方法2．2．1实验用药的配制将金匮肾气丸用研钵研碎，用生理盐水配成浓度为309／]oomz的混悬液，剂量为成人用药剂量的20倍，每只小鼠用专用灌胃器灌胃O．2ml：用无菌注射用水将腺嘌呤配制成浓度为lg／lOOml的溶液，按小鼠体重lOmg／lOOg灌胃0．2ml／只。2．2．2给药剂量与方法正常组：每只小鼠灌胃给予无菌注射用水O．2ml，一日一次；肾虚组：每只小鼠灌胃给予腺嘌呤溶液O．2ml，一日一次：肾虚+补肾组：每只小鼠上午灌胃给予腺嘌呤溶液0．2ml，下午灌胃给予金匮肾气丸混悬液O．2ml；颌下朦切除组

2、：每只小鼠灌胃给予无菌注射用水0．2m／，一日一次；颌下腺切除+补肾组：每只小鼠灌胃给予金匮肾气丸混悬液0．2ml，一日一次。2．2．3标本采集连续给药35天(小鼠一个生榜周期)，于末次给药24h后，经摘除眼球放血处死，摘取各组小鼠左侧睾丸与附睾，并摘取正常组、肾虚组及肾虚+补肾组小鼠左侧颌下腺，摘取组织迅速放入10％中性甲醛溶液中固定。实验中各组小鼠均有因灌胃或殴斗等原因死亡。各组小鼠体重变化及存活只数见下表(袭1)。表1．各组小鼠体重变化及存活只数比较各组小鼠体重变化22．3检测指标与方法2．3．1血清T与EGF水平检测小鼠经眼球摘

3、除取血，离心取上层血清，经放射免疫法测定T与EGF水平。2．3．2附睾内成熟精子计数‘1’取友侧附翠，剥离粘连的血管、脂肪等组织，放入离心管内，加入1．5ml冷生理盐水，用眼科剪充分剪碎，并轻压组织块，使精子溢出，通过双层擦镜纸过滤，滤液经4000转／rain离心10rain，然后弃去上清液，用摄子蘸取少量沉淀物轻轻涂于玻璃片上，干燥后经常规HE染色，在4x10光镜下箍机选取5个视野，用Mias-2000图形分析系统进行计数测量。2．3．3睾丸曲细糟管横截面积与管壁厚度的测量取下小鼠睾丸后，10％qa性甲醛溶液固定48小时，逐级酒精脱水

4、，二甲苯透明、没蜡，石蜡包埋，连续切片3张，每张切片厚度为4l却-n，其中第l张切片作常规HE染色，第2、3张切片作免疫组化染色。在HE染色片上，随机选取lO个视野(100x)，用Mias．2000图形分析系统测量每个视野内曲细精管的横截面积总和与每个曲细精管管壁的厚度，然后计算出每个曲细耪管壁厚度与其横截面积的比值。2．3．4颌下腺闫管分泌颗粒的观察取下小鼠颁下腺后，10％中性甲醛溶液固定48小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片l张，厚度为4№，常规脱蜡至水。作甲苯胺蓝染色，闰管内的分泌颗粒被染成紫色心’。每张切片

5、随机选取5个闰管(200×)，用Mias．2000图形分析系统测量每个闰管的横截面积与管腔内被染成紫色的分泌颗粒的面积，然后计算出分泌颗粒面积相对于其所在闰管横截面积的比值。32．3．5免疫组化染色石蜡切片脱蜡至水；3％H202室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟：10％的正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟：倾去血清，勿洗，滴加l：100稀释的一抗，37'12孵育2小时；PBS冲洗，5分钟×3次：滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃孵育30分钟：PBS冲洗，5分钟×3次；滴加第二代

6、辣根酶标记链霉卵白素工作液，37"C孵育30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次；DAB显色剂显色；自来水充分冲洗，复染，封片。EGFR以胞膜与胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野(100x)，用Mias一2000图形分析系统定量检测阳性细胞中阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度，表示受体表达情况；Ki一67以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野(200×)，用Mias-2000图形分析系统定量检测阳性细胞中阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度，表示细胞的增殖情况。2．4统计方

7、法各项指标均以均数标准差f艾±SD)表示，实验数据用SPSSl0．0软件处理，各组问比较采用单因素方差分析，其中方差齐性者用S-N．K法检验，方差不齐性用Dunnett’ST3法检验；附睾精予数目与血清中T及EGF水平、曲细精管厚度、曲细精管EGFR与Ki-67表达水平、颌下腺分泌颗粒之间的比较采用直线相关分析。3结果与分析3．1对血清T的影响：(见表2)表2．各组小鼠血清T水平比较(j＆SD)与正常缎相比t△P

8、(P(O．01)，而颌下腺切除组小鼠及颌下腺切除+补肾组小鼠血清T水平与正常组相比并无显著差异(P>0．05)。肾虚+补肾组小鼠血清T水平高于肾虚组(P