p2y,1受体介导脊髓背角星形胶质细胞到神经元的信号传递的初步研究

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1、第三军医大学博士学位论文P2Y<,1>受体介导脊髓背角星形胶质细胞到神经元的信号传递的初步研究姓名：曾俊伟申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：阮怀珍20080501第三军医大学博士学位论文p2Y，受体介导脊髓背角星形胶质细胞到神经元的信号传递的初步研究木摘要疼痛对人类的健康危害甚大。脊髓背角既是接受传递外周伤害性信息的初级传入纤维终止的初级门户，又是起源于脑干的对伤害性信息的传入有抑制作用的下行抑制系统的终止部位，对伤害性信息的传递和调制发挥重要作用。以往的基础与临床研究均表明，在病理性痛刺激状

2、态下，星形胶质细胞激活后产生并释放大量神经活性物质和前炎性细胞因子，作用于突触前终末，增强初级传入神经末梢伤害性神经递质的释放及痛信息的传递；作用于突触后的背角痛觉传递神经元，增强其敏感性和反应性，使神经元兴奋性增高。但对于在病理性疼痛产生和维持过程中，参与胶质细胞激活的分子及其机理尚不十分清楚。因此，阐明胶质细胞激活的机理对于解除疼痛折磨意义重大。以往在炎性痛和神经病理性痛模型动物上的研究表明，三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)和谷氨酸(G1ut锄ate，G1u)分别通过

3、受体机制参与伤害性信息的传递与中枢痛敏的形成。ATP通过7种离子通道型P2x受体和9种G．蛋白偶联P2Y受体产生作用。P2Y受体在初级感觉神经元的大、中、小细胞中均有表达，能够引起类似于伤害性反应的细胞兴奋，与痛觉感受有关。在星形胶质细胞表面主要分布有少量P2X受体和较多P2Y受体。但是脊髓背角星形胶质细胞是否表达P2Yl受体蛋白，并参与星形胶质细胞活性调节目前尚不清楚。本项目拟在以往本实验室对P2受体研究的基础上，在离体条件下，综合应用形态学、分子生物学及电生理学方法，观察P2Y1受体功能变化与脊髓背

4、角星形胶质细胞活性变化之间的关系；以星形胶质细胞Glu释放为切入点，从不同角度探讨P2Y1受体对星形胶质细胞功能的调节作用以及其机理；胶质细胞P2Y1受体激活后释放的G1u对背角神经元细胞内钙离子浓度(theintracellularconcentrationofCa2+，【Ca2+】i)以及全细胞膜电流的影响。方法：培养并纯化大鼠脊髓背角星形胶质细胞，免疫组织化学染色和免疫印迹技术观察P2Yl受体表达；激光共聚焦扫描显微镜(Confocallasersc锄ningmicroscopy，CLSM)’国家

5、自然科学基金(N030672022，30470557)7第三军医大学博士学位论文观察ATP、ADP、AD邛S作用下背角星形胶质细胞[Ca2+】i变化；免疫组织化学染色和免疫印迹技术观察ATP、ADP、ADPpS作用后背角星形胶质细胞GFAP表达水平的变化；并观察P2Y1受体特异性拈抗剂MRS2179对ATP、ADP、ADPBS刺激背角星形胶质细胞【Ca2+】i和GⅣ心表达变化的影响。应用高效液相色谱(Hi曲PerfomanceLiquidChromato舯phy，埘，LC)观察ATP、ADP、AD邓S作

6、用下背角星形胶质细胞Glu释放并分析机理；应用CLSM和全细胞膜片钳记录观察星形胶质细胞条件培养基(as昀c弦e—conditionedmedium，ACM)作用下背角神经元[Ca2+]i浓度以及全细胞膜电流的变化。结果：第一部分：1．建立星形胶质细胞培养模型，免疫组织化学染色以及免疫印迹技术均表明体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达P2Y1受体蛋白；2．P2Y受体激动剂ATP、ADP、ADPpS(0．001．100pm01／L)剂量依赖性促进星形胶质细胞[Ca2+】i升高；100¨m01／L的ATP

7、、ADP和ADPpS显著增加[Ca2+]i，此作用可被特异性P2Y1受体拮抗剂MRS2179所阻断，并具量效关系；3．P2Y1受体介导了l00耻m01几ATP、ADP和ADPpS促进星形胶质细胞G吼心表达增强的过程。这一结果提示，P2Y1受体介导星形胶质细胞激活。第二部分：1．P2Y受体激动剂ATP、ADP、ADPBS时间依赖性促进星形胶质细胞G1u释放；此作用可被特异性P2Y1受体拮抗剂MRS2179所阻断；2．ADPBS诱发的Glu释放可以被PLC抑制剂新霉素阻断，但不受细胞外钙浓度变化影响；ADP

8、pS诱发的Glu释放可以被蛋白激酶C(proteinkinaSeC，PKC)阻断剂白屈菜红碱(CheleryⅡⅡ．inechloride，Che)、容量敏感的C1‘通道阻断剂5．硝基．2．3苯酚丙胺苯甲酸盐[5-ni仃0—2(3-phenylpropy1amino)-benzoate，Ⅻ’PB]，Na+一K+-2C1。离子共同转运体阻断剂速尿部分阻断，但不被蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)阻断剂H．89和缝隙连接半通道阻断