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《一种优化的pcr方法——降落pcr扩增目的基因》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、江苏临床医学杂志2002年第6卷第2期 ·127· ●技术与方法一种优化的PCR方法———降落PCR扩增目的基因121311万 兵 闫 杰 季明春 张利宁 申厚凤 陈志琳(1,扬州大学医学院,扬州,225001;2,北京地坛医院,北京,100011)(3,山东大学医学院,济南,250012) 摘 要 目的:尝试用一种新的PCR方法———降落PCR扩增目的基因。方法:在构建人CD137-hIgG1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因。结果:扩增出的特异性条带与目的基因大小一致。结论
2、:降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法。 关键词 优化;降落PCR;退火温度 中图分类号:R446161文献标识码:A文章编号:1007-6514(2002)02-0127-03 多聚酶链式反应(PCR)是在模板DNA、引物第二军医大学曹雪涛教授惠赠;HBVDNA,从6和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA位慢性HBV感染者血清中抽提获得。试剂:PCR[1]聚合酶的酶促反应。在实验室日常工作中经试剂盒购自上海生工生物工程公司。引物:扩增常出现两种情
3、况:一种是因未找到最佳扩增条件人CD137胞膜外区的引物P1:5’CCCAAGCTT导致产生大量非特异性产物,另一种情况是未扩ATGGGAAACAGCTGTTAC3’,P2:5’AAA增出任何产物。影响PCR的因素很多,除了受CTGCAGCTGCGGAGAGTGTCCTG3’;扩PCR仪器性能的制约外,也取决于反应体系和反增hIgG1Fc的引物P3:5’AAACTGCAGTCT2+应条件的设置,其中Mg浓度、缓冲液pH值、循TGTGACAAAACTCAC3’,P4:5’CCCGAA环条件等因素尤为重要,而循环条件中的退火温TTCTCATTTACCCG
4、GAGACAG3’,扩增度又是至关重要的因素。降落PCR是一种设计HBVDNA多聚酶的第一轮引物P5:5’TTCCCC[2]多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从CACTGTCTGGCTTTCAGTCAT3’,P6:5’而达到最佳扩增条件的方法。我们在构建人ATACCCAAAGACAAAAGAAAA3’,第二轮CD137-hIgG1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达引物P7:5’TTCCCCCACTGTCTGGCTTTC载体以及在检测HBVDNA多聚酶基因突变的过AGTCAT3’,P8:5’ATACCCAAAGACAAA程中运用降落PCR进行了扩增
5、目的基因的尝试。AGAAAA3’由上海生工生物工程公司合成。112 降落PCR扩增目的基因1 材料和方法反应体积为50μl,人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系:CD137-pCDNA3质粒4μl,P1,111 质粒含有人CD137全长cDNA序列的pCDNA3P2各015μmol/L,MgCl22mmol/L,质粒(CD137-pCDNA3),由HerbertSchwarz教dNTP014mmol/L,Taq5U;hIgG1Fc片段的PCR扩增体系:含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4μl,授惠赠;含hIgG1FccDNA的PGEM-T质粒由
6、P3、P4各014μmol/L,MgCl22mmol/L,收稿日期:2001-11-13dNTP014mmol/L,Taq5U;HBVDNA多聚酶基作者简历:万 兵(1975-),男,江苏江都市人,硕士研究生,发表论文因的PCR扩增体系,第一轮:HBVDNA模板3篇。4μl,P5、P6各0125μmol/L,MgCl2115mmol/L,©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.·128·dNTP012mmol/L,Taq018U,第二轮:取5倍稀L,Taq018U。
7、分别在各灭菌PCR管加入上述各释的第一轮PCR产物4μl为模板,P7、P8各反应成分,100℃煮沸5min,立即冰浴5min,加入0125μmol/L,MgCl2115mmol/L,dNTP012mmol/TaqDNA聚合酶,混匀,离心,PCR程序如下:取10μlPCR扩增产物,在2%或3%琼脂糖凝胶的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件的[3]上电泳,紫外灯下观察扩增产物。方法,反应过程中起始退火温度高于Tm值,随着循环的进行,退火温度逐渐降低到Tm值,从而2 结 果确保第一个引物-模板杂交事件发生在最互补的分别扩增出大小为558bp、708bp
8、和大小为反应物之间,退火温度最终低于Tm值。退火温116bp的特异性片段,与人CD137胞膜外区、度的范围可
