hgm-csf在鱼腥藻7120中的表达及基因修饰对其表达效率影响的研究

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1、上海师范大学硕士学位论文hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达及基因修饰对其表达效率影响的研究姓名：魏兰珍申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：王全喜;施定基20050501魏兰珍;bGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达及基因修饰对其表达效率影响的研究摘，己石3(自从1982年全世界第一个基因重组药物“人胰岛素”在美国上市以来，己有近百种生物技术药品上市。我国批准上市的生物工程药品也有巧种之多，而且生物药品种类在大幅度增加，销售额也以每年20%的速度递增。因此，生物工程药物的开发将是国内外今后很长一段时期的研究热点。人粒一巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF

2、)作为一种主要的造血生长因子，能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化，具有极其重要的免疫调解功能，在造血调控和免疫调节中发挥着重要作用。但是天然hGM-CSF因制备量少，纯度不够高等原因，远不能满足市场需求。因此，用基因工程来生产hGM-CSF有其重要经济意义和独特的优越性。蓝藻作为基因工程重要的受体系统之一，有其独特的优点:(1)不形成包涵体;(2)通常不含内毒素;(3)蛋白酶活性低:(4)培养基低廉:(5)生长速度快;(6)含有对人体有益的营养保健成分。因此，本研究选择鱼腥藻7120作为受体系统，利用蓝藻基因工程来制备重组的hGM-CSF.外源基因在蓝藻细胞

3、中表达效率较低一直以来可能都是制约蓝藻基因工程长足发展的一个重要原因。而hGM-CSF的cDNA5’端起始序列中G,C含量较高并存在一些不偏好的密码子等使其不利于在蓝藻细胞中进行高效地表达。因此本研究根据密码子偏好性，运用PCR手段，在不改变氨基酸序列的前提下对hGM-CSF的cDNA5'端进行插入和定点突变，并在其5'端添加利于在蓝藻细胞中高效表达的SD序列及启始密码子ATG，然后将hGM-CSF编码区插入到穿梭载体(pPL-439)强启动子PpsbA的下游，进一步与穿俊表达载体pDC-08相连构建成穿梭表达载体pDC-GM,。为了研究密码子偏好性讨外源基因在蓝

4、藻中表达效率的影响，我们利用未修饰的hGM-CSF基因构建丁穿梭表达载体pDC-GMo。利用三亲接合转移将该穿梭表达载体(pDC-GM，和pDC-GMo)转入丝状鱼腥藻7120，通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到能稳定遗传的转pDC-GM。基因鱼腥藻7120(GMo藻株)和转pDC-GM。基因的鱼腥藻1120(GM1藻株)。以两种转基因藻基因组DNA为模板进行PCR检测，结果表明hGM-CSF基因已分别转入GMo藻株和GM,藻株中。WesternBlot分析表明，在两种转基因藻中均表达了具有免疫活性的hGM-CSF。并且，修饰后的hGM-CSF基因与未修饰的相比

5、，在GM,藻株中的表达量比在GMo藻株中提高了136%0对两种转基因藻的生长情况测定表明，在常规培养条件下，GMo藻株、GM,藻株与野生藻的细胞密度和叶绿素含量类似。光合放氧测定的结果显示，在添加lomm的NaHCO3后，GM,,藻株的净光合和真实光合均与野生藻类似;而GM,藻株的净光，_海iI)i;i范人学硕}论义摘要合和真实光合却有明显提高。与GM0藻株相比，GM,藻株的净光合提高了35.6%,真实光合上调了29.2%，光补偿点下降了19%，光饱和点上升了3.7%。说明基因修饰后转化得到的转基因藻有着良好的光能利用效率，这对于下游工程至关重要。本研究首次尝试利

6、用基因工程手段在鱼腥藻7120中表达了具有免疫活性的hGM-CSF;通过基因修饰对hGM-CSF进行改造，并转化鱼腥藻，来探讨基因修饰对hGM-CSF表达效率的影响，结果表明，在GM,藻株细胞中，基因修饰明显提高了hGM-CSF的表达效率和光合放氧活性。为将来利用蓝藻制备hGM-CSF的口服制剂以及研究如何提高外源基因在蓝藻细胞中的表达作了一些探索性的工作。关键词:人粒一巨噬细胞集落刺激因子，鱼腥藻7120，三亲接合转移，转基因蓝藻，生长曲线，光合放氧，基因修饰魏兰珍:hGYt-CSF在鱼腥藻7120中的表达及基因修饰对其表达效率影响的研究Studiesonthe

7、expressionofhGM-CSFinAnabaenasp.PCC7120andtheefectsonitsefficiencybythegenemodificationLanzhenWETDepartmentofBiology,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,ChinaItiswellknownthatsincethefirstrecombinationmedicine,humaninsulin,hadbeenappearedinAmericain1982,moreandmorerecombinationmed

8、icine