hela细胞核仁rrna基因转录和pre-rrna剪切与超微结构动态关系研究

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1、东北师范大学博士学位论文HeLa细胞核仁rRNA基因转录和pre-rRNA剪切与超微结构动态关系研究姓名：王凤才申请学位级别：博士专业：生物学指导教师：郝水;焦明大20061101摘要核仁是真核生物很显著的哑细胞结构之一。在细胞合成蛋白质中具有非常重要的作用一核仁制造了核糖体大小亚单位。核仁主要由FC(fibrillarcenter)和DFC(densefibrillarcomponent)以及GC(granularcomponent)等超微结构组成，普遍存在于动物细胞，植物细胞和酵母细胞核中。每个细胞核中核仁的数量从一个到数个不等。核仁在有丝

2、分裂前期解体并停止转录核糖rRNA，在有丝分裂末期恢复转录核糖体rRNA并重新形成核仁。虽然人们对于核仁的认识已经有很长的历史了，但是人们对于核仁结构和功能方面的认识仍然有很多不同的意见。其中意见分歧较为明显的是，关于GI(Go)和G2期核仁超微结构FC和DFC大小有分歧，关于核仁rDNA分布以及rRNA基因转录位点有不同的意见，关于核仁剪切位点的研究方面也存在分歧。在相关的研究中有时甚至所取用的材料相同方法也相同，但是结果却不同。对于核仁结构和功能在细胞问期中各个时期动态变化过程缺乏系统全面的了解可能是产生上述分歧的原因之一。本实验用HeLa

3、细胞为实验材料，利用常规电镜、细胞化学方法、免疫电镜技术以及原位杂交技术对在Gl期、S期和G2期OHeLa细胞核仁超微结构及其变化，②核仁rDNA在不同时期分布规律及其变化，⑨各个时期核仁rRNA基因转录位点及其变化，@pre-rRNA早期剪切位点及其变化进行了研究。结果显示，HeLa细胞问期核仁的结构和功能都经历了高度动态的复杂变化：1、通过对经过同步化培养的HeLa细胞做常规电镜观察显示，HeLa细胞核仁结构在细胞问期的各个时期是不同的。G1期细胞核中有数个小核仁，每个小核仁含有一个FC和DFC。随后有些小核仁互相融合形成大型核仁。在融合中

4、的核仁内不同FC之问也发生了融合过程，形成了比较大型的FC和DFC。S期在大型FC周围的DFC发生改构现象，在FC和DFC之间形成一些腔隙，这些腔隙发展成为小型FC和DFC。我们把在Gl期早期形成和出现的FC和DFC称为初级FC和初级DFC，把在S期从初级FC和初级DFC上形成的FC和DFC称为次级FC和次级DFC。G2期为数众多的小的次级FC和DFC与初级大型FC和DFC共同存在于核仁中。2、NAMA-Ur染色使核仁中rDNA的分布走向及其在不同细胞时期的变化得以显示。在初级FC中rDNA纤维密集分布，质地均一，互相之间搅扭缠绕在一起形成一个

5、比较规范的球形体结构。DFC中rDNA纤维分布不均匀，成束的rDNA纤维放射状分布于球形体FC周围，核仁次级FC和次级DFC的衍生过程发生在靠近FC和DFC中的DNA组分中，DFC中的rDNA组分随细胞周期的进行不断增多。在核仁外三分之一处围绕着一层很厚的常规电镜下看不到的由凝聚状态不同的核仁周缘染色质纤维结构。这种核仁周缘染色质结构参与了核仁形态和位置的维持过程。因为当HeLa细胞进入到G2期末期核仁周缘染色质开始凝聚时，位于核仁周缘的染色质组分逐渐消失，核仁形态也随之消失。3、对HeLa细胞核仁rRNA基因转录位点免疫标记结果显示，标记信号

6、出现在FC和DFC交界处和DFC区域。在s期剐刚形成的次级FC内部也有一些金颗粒标记信号。这在某种程度上能够解释为什么在研究核仁转录位点问题上用同样的实验材料和同样的方法却出现不同的实验结果。4、U3snoRNA原位杂交结果显示，金颗粒在各个时期都出现在Fc和DFC交界处和DFC区域以及GC区域。在FC中没有金颗粒信号出现。总之，从我们的实验结果中可以看出，在HeLa细胞核中，从Gl期经s期到G2期核仁的超微结构和转录功能以及剪切功能发生了一系列动态变化。这种变化不仅体现在核仁超微结构的衍生过程，也体现在随着这种超微结构变化带来的核仁转录位点的

7、改变。核仁的转录和剪切活动随着细胞周期的推进逐渐增强。核仁转录位点和剪切位点的一致说明了核仁中rRNA基因是呈放射状分布于核仁中的Fc周围。HeLa细胞核仁在细胞问期的这种高度动态的变化反映了核仁结构和功能之间存在的相互协调关系。本实验结果拓展了对于核仁超微结构在细胞问期动态变化的认识，有利于统一关于核仁Fc和DFC在不同时期大小变化的争论和关于核糖体基因转录位点研究的不同意见，为进一步研究核仁结构和功能提供了实验数据。关键诃：初级FC和初级DFC；次级FC和次级DFC：核仁周缘染色质；Gl期、s期和(32期转录和剪切IIAbstractNue

8、leolm1Soneoftheprominentnuclearstructuresineukaryoticcellandthetwosubunitso