ephb6在结直肠癌中的表达及其临床病理意义的研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文EphB6在结直肠癌中的表达及其临床病理意义的研究EphB6expressioninhumancolOrectalcanceranditsclinicopat耋loIogicalsignificance课题来源：导师指导课题受国家自然科学基金资助(81371611)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员彭李博王建东副教授病理学与病理生理学学术型硕士研究生学院冯振卿教授周晓军教授石群立教授李芳秋教授张春妮教授2014年5月20日广州硕士学位论文EphB

2、6在结直肠癌中的表达及其临床病理意义的研究篙罢I渊必指导老师王建东YzbrI石。斗。摘要结直肠癌(c010rectalcancer，CRc)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率高居全球恶性肿瘤的第二位。随着我国人民生活水平的不断提高和人口老龄化的趋势，其发病率和死亡率不断增加。尽管目前大部分患者接受了外科手术治疗和辅助放化疗，但由于患者体内往往残留少量的微小癌灶而导致复发或转移，其5年生存率仍然不高。结直肠癌的发生发展是多步骤、多基因参与的过程，包括致癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因组稳定性调控系统和DNA启动子区甲

3、基化的改变等。由于发生过程的复杂性，其发病机制目前尚不明确，因此寻找结直肠癌早期诊断、疾病监测、治疗和预后评估相关的生物学指标具有重要意义。促红细胞生成素产生肝细胞激酶(Erythr叩oietin-pmducinghepatocyte，Eph)是受体酪氨酸激酶中最大的家族，根据序列同源性、结构和配体结合特性的不同，Eph受体被分为EphA和EphB两大类，Eph受体及其配体Ep蜥n在生物体胚胎发育、神经轴突导向、血管生成和细胞迁移等方面发挥重要的生物学功能。近年来，它在恶性肿瘤中的作用也越来越受到重视。Eph受体及其配体之

4、间的相互作用被证实在肿瘤的生长、侵袭、血管生成和转移方面都发挥着重要作用。EphB6是Eph家族的新成员，由于激酶结构域某些保守氨基酸的突变，导致其缺乏激酶活性。新近的研究发现，EphB6在多种恶性肿瘤中低表达，与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。EphB6在转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌摘要及具有转移潜能的浸润性乳腺癌细胞系中表达下调，且其低表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移及患者的预后相关。另一方面，EphB受体的其他成员在结直肠癌中也存在不同程度的沉默，其表达缺失与患者的临床分期及生存时问相关，EpllB的表达越少，肿

5、瘤的恶性程度就越高，患者的生存期就越短。研究人员检测EphB2在正常肠隐窝干细胞、肠腺瘤细胞、肠原位癌细胞、肠癌淋巴结转移细胞和肝转移细胞中的表达，发现EphB2的表达呈逐渐递减趋势；提示EpllB2的表达下调促进了结直肠癌的发生及进展；53％结直肠癌患者中检测到了EphB2启动子甲基化，应用甲基化转移酶抑制剂5’．氮杂．2’．脱氧胞苷处理结肠癌细胞系，EphB2表达重新恢复，由此证实了EpllB2高甲基化是其在结直肠癌中表达下调的机制。而目前关于EpllB6在结直肠癌中的表达情况及其临床病理意义的研究国内外尚未见报道。目

6、的：本研究运用免疫组化检测EpllB6蛋白在结直肠癌癌组织、腺瘤、正常肠粘膜组织中的表达，采用实时荧光定量PCR技术检测EphB6mRNA在结直肠癌癌组织、癌旁正常组织以及结肠癌细胞系和正常肠上皮细胞系中的表达，分析EphB6蛋白表达水平与患者临床病理参数及预后的关系，应用甲基化特异性PCR检测EphB6基因启动子在结肠癌细胞系中的甲基化状态，在表观遗传学层面研究其表达水平可能的发生机制，从而为结直肠癌的疾病监测、病程进展和预后评估提供新的线索。材料本研究所用石蜡组织标本均为南京军区南京总医院病理科存档病例，收集124例结

7、直肠癌、57例腺瘤的石蜡组织标本。所取新鲜组织标本均为在南京军区南京总医院接受手术治疗的结直肠癌患者，收集新鲜组织标本43例，于肿瘤根治术后切取癌组织及癌旁组织标本。患者术前均未接受放化疗，所有病理切片均由两位高年资病理医师双盲阅片诊断。所取标本均获得患者知情同意，并获得医院伦理委员会批准。硕士学位论文本研究所采用的结肠癌细胞株HcTll6、HT29、SW620、SW480均来自日本浜松医科大学相村教授惠赠，人正常肠上皮细胞系NCM460购自上海复旦中科生物医药研发服务中心，作为阳性对照的乳腺癌细胞系MDA．MB．231购

8、自上海细胞库。方法1．免疫组化染色(Envision法)组织标本经4％中性甲醛固定，常规石蜡包埋，切4岬厚的组织切片置于防脱玻片上，常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水，采用柠檬酸盐法进行抗原修复，在高压锅中保持沸腾状态10分钟，取出后自然冷却至常温，O．3％H202．甲醇封闭内源性过氧化物酶，加入1：100抗