牛疱疹病毒型特异编码的ul0.5基因生物学特性研究

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1、华中农业大学硕士学位论文牛疱疹病毒型特异编码的UL0.5基因生物学特性研究姓名：张炜申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刘正飞201206牛疱疹病毒1型特异编码的UL0．5基因生物学特性研究摘要牛疱疹病毒1型(BHV．1)和牛疱疹病毒5型(BHV．5)是两种非常相近的0t疱疹病毒，两者DNA序列的相似性高达85％，氨基酸同源性为82％。牛疱疹病毒1型不具有中枢神经侵染力，通常引起牛传染性鼻气管炎(IBR)、妊娠母牛流产、呼吸系统疾病，而牛疱疹病毒5型是嗜神经病毒，可侵入中枢神经系统(CNS)，引起犊牛脑膜炎。牛疱疹病毒1型和牛疱疹病毒5型都可以在三叉神经

2、节中建立潜伏感染致使被感染动物终身带毒，并且这两种病毒有共同的抗原性和血清学交叉反应，为短期内彻底扑灭这两种病毒带来了很大的困难。目前，区分这两种病毒的机制仍不清楚，但是随着BHV．1和BHV．5基因组测序工作的完成，通过基因组序列的比对分析发现，BHV．5所有的基因均能在BHV．1中找到与之对应的基因，但是BHV．1有一个独特的基因，即UL0．5，在所有的a疱疹病毒中都没有找到与之同源的基因。这个经预测可编码87个氨基酸的基因位于UL区和IR区之间，目前还未有关于其生物学特性及功能的报道。因此，本课题展开了对BHV．1UL0．5基因的研究，初步探究UL0．5基

3、因的生物学特性和功能。我们首先证实了UL0．5可以转录为mRNA，然后证实了UL0．5可以编码为蛋白质，又进～步证实了UL0．5基因是BHV．1的非必须基因、UL0．5编码的蛋白为BHV．1的结构蛋白，并且分布在细胞质中。还通过体内实验和体外实验对比了BHV．1和BHV．1△UL0．5的差异。1、UL0．5的生物学特性研究在实验中通过反转录PCR的方法证实了在BHV．1感染的MDBK细胞中，UL0．5基因可以转录为mRNA。克隆并原核表达了UL0．5基因，制备了BHV．1牛多抗血清和兔UI。0．5多克隆抗体，用IBR阳性血清对原核表达的UL0．5蛋白进行了检测，

4、证实了UI。0．5在BHV．1感染的MDBK细胞中可以编码蛋白。对BHV．1病毒粒子和病毒感染的细胞裂解物也进行了westernblot检测以及间接免疫荧光实验，证实了UL0．5编码的蛋白是BHV．1的结构蛋白。通过荧光示踪的方法，观察到UL0．5蛋白和其上游的UL0．7蛋白均分布在细胞质中，并且有部分荧光重合，推测UL0．5可能与UL0．7相互作用形成二聚体结构共同发挥作用。然后用PAA实验证实了UL0．5为早期基因。通过以上实验，我们对UL0．5基因的生物学特性有了初步的认识。2、UL0．5功能分析用本实验室已经构建好的BHV．1UL0．5缺失病毒和野毒分别

5、感染实验兔子，在急性感染期、潜伏感染期和再激活期分离眼拭子中的病毒进行空斑实验，绘制病毒分离滴度图。发现缺失UL0．5基因后，病毒能建立潜伏感染且依旧能够再激活，证明UL0．5：是BHV．1的非必需基因。处死实验兔子后，取出三叉神经节、抽提总DNA，1华中农业大学2012届硕士学位论文用保守的gB做探针对野毒和缺失毒株的基因组拷贝数进行绝对定量PCR实验。结果发现，缺失病毒在急性感染期、潜伏感染期和再激活期的基因组拷贝数比与野毒相比差异不明显。为了在体外检测缺失UL0．5后对病毒增殖能力的影响，将BHV．1AUL0．5和BHV．1叭分别接种MDBK细胞，感染后分

6、时间点收毒，通过相对定量PCR检测各个时间点中bICP0、ORF2的转录水平。结果发现在细胞感染早期，UL0．5可以影响bICP0和OFR2的转录，但是在12hpi后，这种影响逐渐消失。本论文研究结果表明，UL0．5编码的蛋白是BHV．1的结构蛋白，且主要分布在细胞质中，UL0．5基因在病毒感染早期可影响bICP0和ORF2的转录水平。关键词：牛疱疹病毒l型；UL0．5基因；结构蛋白牛疱疹病毒1型特异编码的UL0．5基因生物学特性研究AbstractBovineherpesvirusl(BHV．1)andbovineherpesvirus5(BrW一5)，two

7、closelyrelatedviruses，belongtOtheorderofherpesvirales，herpesvifidaefamily，aherpesvifinaesubfamily，andvaricellovirusgenus．BHV-1isthecausativeagentfortheupperrespiratorytractdisorder(knownasinfectiOtISbovinerhinotracheitis，IBR)，conjunctivitis，genitaldisorder，abortion，andimmunesuppressi

8、onincattle，a